El aguacate (Persea americana Mill.) es uno de los frutos más importantes del mundo, reconocido por sus beneficios para la salud, especialmente por sus ácidos grasos, lo que lo ha convertido en un alimento esencial en la dieta de muchos países (Fonseca et al., 2016). Sin embargo, su producción está limitada por factores como plagas, enfermedades (Ploetz et al., 2015; Sharma et al., 2017) y condiciones abióticas (Bonomelli et al., 2018).
La incorporación de nuevas características en el aguacate mediante el mejoramiento genético tradicional es compleja debido a un largo período vegetativo (aproximadamente 6 a 8 años) y a la dificultad de autopolinización por su protoginia (Imbert, 1997; Gazit y Degani, 2002). En este contexto, la variedad Drymifolia de aguacate (Persea americana Mill.), una raza mexicana usada frecuentemente como portainjerto en huertos (Rincón-Hernández et al., 2011), es un candidato clave para la aplicación de técnicas biotecnológicas.
Para la mejora genética, conservación y propagación clonal de variedades como Drymifolia, es crucial implementar técnicas de embriogénesis somática y organogénesis in vitro.
Desafíos y Estrategias en la Propagación In Vitro del Aguacate
La conservación o el mejoramiento genético in vitro requiere un sistema eficiente de regeneración de una planta completa a partir de embriogénesis somática u organogénesis adventicia. En la organogénesis, los brotes pueden formarse directamente del explante o indirectamente a partir de callos.
A pesar de su potencial, la eficiencia de regeneración de plantas de aguacate por organogénesis in vitro a partir de tejidos asexuales de árboles es generalmente baja y altamente dependiente de la variedad (Bandaralage et al., 2017). Algunos éxitos en micropropagación se han reportado utilizando explantes nodales, tejidos juveniles y brotes axilares de plántulas (Martínez-Pacheco et al., 2010).
Los principales obstáculos para el establecimiento in vitro del aguacate incluyen la contaminación por bacterias y hongos, así como el oscurecimiento del explante (Nhut et al., 2008). Para la regeneración embriogénica, se han utilizado diferentes explantes, como embriones cigóticos inmaduros en estadio globular o nucela (Pliego-Alfaro y Murashige, 1988; Witjaksono y Litz, 1999; Suarez et al., 2006). Sin embargo, hasta la fecha de este estudio, no se había reportado un sistema de embriogénesis específico para la variedad Drymifolia.
Estudio de Embriogénesis Somática y Organogénesis en la Variedad Drymifolia
Un estudio realizado entre 2016 y 2018 evaluó la embriogénesis somática directa, indirecta y la organogénesis de la variedad Drymifolia. Este trabajo proporciona un enfoque prometedor para la regeneración y multiplicación de plantas de P. americana var. Drymifolia.
Materiales y Métodos del Estudio
Origen y Preparación del Material Vegetal
El material vegetal se obtuvo del banco de germoplasma del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias en Celaya, México, durante el ciclo primavera-verano. Los árboles de aguacate variedad Drymifolia, con un promedio de seis años, fueron fertilizados anualmente con NPK (200-200-300) y Ca, Mg, Fe y Zn (25-05-01-1.5).
Se colectaron frutos inmaduros de aguacate de 5-8 cm de diámetro de las accesiones: Celaya 79, Comonfort 53, San Miguel, BG24, BG181 y Zutano (híbrido de raza mexicana × raza guatemalteca). Estos frutos se lavaron con jabón desinfectante (Dermocleen®), se enjuagaron con agua de la llave, se embebieron en hipoclorito de sodio comercial (Cloralex®) durante 10 minutos y se enjuagaron tres veces con agua esterilizada por un minuto.
Preparación de Medios de Cultivo
- Medio de inducción (I): Consistió en sales de Gamborg modificadas (GM) (Gamborg et al., 1968; Perán-Quesada et al., 2004) suplementadas con 1 mg L-1 de piridoxina, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol, 1 g L-1 de carbón activado, 30 g L-1 de sacarosa, 8 g L-1 de agar (Sigma-Aldrich), y diferentes concentraciones de ácido 1-naftalenacético (ANA) (2, 5 o 10 mg L-1), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (5 o 10 mg L-1) o ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico (picloram) (0.05, 0.1 o 0.2 mg L-1). El pH se ajustó a 5.7, se esterilizó en autoclave a 121 °C por 15 minutos, y se vertieron 30 ml por caja Petri (100×25 mm) en campana de flujo laminar. Los embriones cigóticos (EC) de todas las accesiones se cultivaron en este medio y se mantuvieron en oscuridad a 30 °C hasta la inducción de embriones somáticos (ES).
- Medio de inducción de callos (IC): Contenía sales GM con 1 mg L-1 de piridoxina, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol, 1 g L-1 de carbón activado, 30 g L-1 de sacarosa, 8 mg L-1 de agar (Sigma-Aldrich) y 0.2 mg L-1 de picloram, ajustado a pH 5.7. Los callos embriogénicos (CE) se subcultivaron en IC cada dos semanas.
- Medio de maduración (M): Para inducir la maduración de los ES, estos se transfirieron a un medio con sales GM adicionadas con 1 mg L-1 de piridoxina, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol, 1 g L-1 de carbón activado, 30 g L-1 de sacarosa, 16 g L-1 de agar (Sigma-Aldrich) y 0.2 mg L-1 de picloram.
- Medio de germinación (GE): Consistió en sales GM (Gamborg et al., 1968) con 1 mg L-1 de piridoxina, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol, 50 g L-1 de sacarosa, 2.5 g L-1 de Phytagel® (Sigma-Aldrich), 0.5 mg L-1 de 6-N-bencil amino purina (BAP) y 1 mg L-1 de ácido giberélico (GA3), ajustado a pH 5.7. Los ES maduros en etapa cotiledonar (5-10 mm de diámetro) se colocaron en cajas Petri (10 por caja) y se subcultivaron cada dos semanas hasta la germinación (6-8 semanas).
- Medio de organogénesis: Los meristemos apicales disectados de los EC se cultivaron en medio I de organogénesis con sales GM, 30 mg L-1 de sacarosa, 1 mg L-1 de piridoxina, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol, 2.5 g L-1 de Phytagel® (Sigma-Aldrich), con o sin reguladores de crecimiento (RC) (0.5 mg L-1 de BAP y 1 mg L-1 de AG3). El pH se ajustó a 5.7.
- Medio de enraizamiento (R): Compuesto por sales GM con 1 mg L-1 de piridoxina, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol, 25 mg L-1 de ácido indol-3-butírico (AIB), 30 g L-1 de sacarosa y 2.5 mg L-1 de Phytagel® (Sigma-Aldrich), ajustado a pH 5.7.
Las plántulas regeneradas in vitro se aclimataron en macetas con vermiculita, cubiertas con bolsas de plástico, regadas con la mitad de la concentración del medio Murashige y Skoog (MS) cada 3 días, y cultivadas a 25 ±2 °C con 16 h de luz en una cámara de crecimiento por aproximadamente dos meses.
Diseño Experimental
Para la embriogénesis somática directa e indirecta, la unidad experimental (UE) fue una caja de Petri con 5 EC, con tres repeticiones por cada accesión (Celaya 79, Comonfort 53, San Miguel, BG24, BG181 y Zutano) y diferentes concentraciones de ANA, 2,4-D o picloram. Para evaluar la viabilidad de los callos embriogénicos en el tiempo, se utilizaron 50 mg de callos por caja Petri como UE con 5 repeticiones, evaluando la regeneración al mes 1, 3, 6 y 9 de inducidos.
La UE para la organogénesis fue una caja de Petri con 10 explantes de cada accesión y cinco réplicas, con o sin reguladores de crecimiento. Se utilizó un diseño completamente al azar para cada experimento.
Resultados y Discusión
Embriogénesis Somática Directa
En este estudio, a diferencia de trabajos previos con Persea americana var. Hass que utilizaron embriones cigóticos (EC) en etapa globular (Pliego-Alfaro y Murashige, 1988; Witjaksono y Litz, 1999), se aislaron EC en etapa cotiledonar de frutos inmaduros de varias accesiones de P. americana var. Drymifolia y del híbrido Zutano. Todos los EC mostraron primordios foliares, hipocotilo y ápice radicular. De las seis accesiones evaluadas, solo San Miguel respondió al proceso de embriogénesis somática directa. Este hallazgo concuerda con otros autores (Pliego-Alfaro y Murashige, 1988; Witjaksono y Litz, 1999; Raharjo y Litz, 2005), quienes señalaron la dependencia genotípica de la respuesta embriogénica.
La eficiencia más alta de regeneración en la embriogénesis directa se obtuvo con 0.2 mg L-1 de picloram (46%) y 10 mg L-1 de ANA (40%). Estos tratamientos resultaron en el mayor número de plantas por explante. Fehér (2019) sugirió que el inicio de la formación de embriones puede originarse en células del periciclo tipo madre, compartiendo pasos iniciales con la formación de raíces laterales.
Tras 15 días en el medio de inducción (I), los grupos de ES que se formaron por explante se desarrollaron de manera sincronizada en algunos casos, mientras que en otros EC, las fases de desarrollo (globular, torpedo y corazón) eran diferentes. La maduración de los ES ocurrió en el medio M con 0.2 mg L-1 de picloram, evidenciada por un cambio de color de translúcido a blanco opaco y la transición a la etapa cotiledonar, aproximadamente dos semanas después del cultivo en medio M.
En la etapa de maduración, los ES se escindieron del EC y se mantuvieron en el mismo medio hasta alcanzar un tamaño de 5-10 mm (dos semanas). Posteriormente, se transfirieron al medio de germinación (GE). Después de 15 días en presencia de luz, los embriones maduros comenzaron a fotosintetizar y germinaron después de 30 días de cultivo en el medio GE. Este resultado difiere de lo reportado por Encina et al. Se observó que no todos los embriones maduros germinaron bipolarmente (ápice y raíz), lo que, según Raharjo y Litz (2003), se presenta con baja frecuencia. Por ello, los embriones unipolares germinados (aproximadamente 2 cm de altura, 3 semanas en GE) se separaron de los cotiledones y se transfirieron al medio de enraizamiento (R), y luego al medio E para promover la elongación apical y el crecimiento radicular. Finalmente, se necesitaron dos meses para su adaptación a condiciones ex vitro.
El sistema de regeneración por embriogénesis somática directa en aguacate, no descrito anteriormente para esta variedad, optimiza el tiempo para obtener plantas completas. El proceso completo, desde la inducción de ES hasta la aclimatación, tomó aproximadamente seis meses, en contraste con reportes más recientes que requieren hasta 14 meses (Encina et al., 2014).
Embriogénesis Somática Indirecta
En la embriogénesis indirecta, la accesión San Miguel formó callos con 0.2 mg L-1 de picloram, mostrando una eficiencia de regeneración del 45% y conservando su potencial regenerativo hasta por seis meses.
Los EC de la accesión San Miguel cultivados en 0.2 mg L-1 de picloram desarrollaron callos embriogénicos (CE). El 50% de los callos formados se mantuvo en medio IC, y el otro 50% se transfirió a medio M. De cada 50 mg de CE en medio M, se obtuvo el máximo potencial de regeneración entre el primer y tercer mes post-inducción sin diferencias significativas. En promedio, 10.2 y 10 embriones maduraron, de los cuales germinaron el 66% y 60% respectivamente, resultando en un 45% y 44% de plantas completas.
Organogénesis In Vitro
En cuanto a la organogénesis, se cultivaron embriones cigóticos inmaduros decapitados en medios con o sin reguladores de crecimiento, y las seis accesiones respondieron positivamente a ambas condiciones. La accesión Comonfort 53 mostró la mayor eficiencia de regeneración (54%) cuando se utilizaron reguladores de crecimiento.
Perspectivas y Avances en la Investigación de Embriogénesis Somática de Aguacate
La investigación en embriogénesis somática de aguacate se extiende a otras variedades y problemáticas. Un estudio previo tuvo como objetivo evaluar morfológica e histológicamente las etapas de formación de la embriogénesis somática en las variedades Duke 7 y Puebla, conocidas por su tolerancia a problemas radiculares causados por Phytophthora y Fusarium. El fin era obtener un protocolo de regeneración de embriones somáticos a plantas completas a partir de explantes como tejido foliar, tejido nuclear y embriones cigóticos inmaduros. Para ello, se desinfectaron brotes y frutos inmaduros de ambas variedades para inducir la brotación de hojas in vitro y obtener los explantes requeridos.
Los resultados de este estudio indicaron que, en la etapa de inducción de cultivos embriogénicos, un medio de cultivo MS suplementado con 0.1 mg L-1 de picloram mostró un mayor número de callos embriogénicos. En la etapa de mantenimiento de callos embriogénicos, se empleó un medio de cultivo semisólido.
La producción de aguacate globalmente está limitada por enfermedades como la podredumbre de raíz causada por Phytophthora cinnamomi, y en ciertas regiones, por la podredumbre blanca causada por Rosellinia necatriz (Zilberstaine y Ben-Ya'acov, 1999). La propagación de genotipos tolerantes a P. Cinnamomi es un proceso largo y costoso que requiere injerto en patrón nodriza y etiolación del brote. Para R. Necatrix, aún no existen patrones tolerantes.
Las herramientas biotecnológicas, como la embriogénesis somática, son fundamentales para la mejora del aguacate, aunque su aplicación requiere sistemas de regeneración eficientes. Se ha concluido que la tipología del callo (SE o PEM) influye en la capacidad para formar embriones somáticos blanco-opacos (ESBO), siendo el callo tipo SE más adecuado para obtener ES en estadios avanzados de desarrollo.
Asimismo, la inclusión de una fase previa de cultivo en suspensión mejora significativamente la capacidad para desarrollar ESBO, con requisitos específicos (densidad de inóculo, tiempo en suspensión) para cada tipo de callo. Se ha desarrollado un protocolo que permite la obtención de grandes cantidades de ESBO, donde el tipo y la concentración del agente gelificante (siendo agar a 10g/L el más adecuado) son críticos.
La incorporación de una etapa de maduración mejora drásticamente la conversión a plantas de embriones zigóticos inmaduros, especialmente al suplementar el medio de maduración con sacarosa y nitrógeno orgánico. Esta observación es valiosa para programas de mejora genética, dado que la alta tasa de abscisión de frutos en el aguacate limita los rendimientos de cruzamientos dirigidos. Si bien la desecación parcial en atmósfera de alta humedad relativa mejora la conversión de embriones zigóticos inmaduros, estos efectos positivos no han sido extrapolables directamente a los embriones somáticos.