El pino marítimo (*Pinus pinaster* Aiton) es, en la actualidad, la conífera más empleada en las repoblaciones artificiales de la Península Ibérica. Su elevada diversidad genética en el Estado Español sugiere un gran potencial de adaptación, siendo elegido como modelo para el estudio de la respuesta adaptativa de las coníferas al estrés hídrico. Esta especie es crucial para la investigación genómica en Europa y es una de las coníferas más abundantes en el Mediterráneo occidental, considerada un organismo modelo para el estudio de la respuesta adaptativa al estrés ambiental desde un enfoque genómico debido a su amplia variabilidad ecológica.
La propagación clonal mediante embriogénesis somática (ES) es la herramienta más adecuada para la propagación de genotipos de élite y para la implementación de la llamada silvicultura multivarietal. Además, los cultivos embriogénicos son explantos adecuados para iniciar experimentos de transformación genética con vistas a la introducción de características de interés o para estudios de genómica funcional. Sin embargo, a pesar de su importancia, en los últimos años el pino marítimo está siendo amenazado por las condiciones climáticas adversas, las cuales están provocando desde aumentos locales en las tasas de mortalidad hasta episodios agudos a escala regional.
Desafíos y Optimización de la Embriogénesis Somática en *Pinus pinaster*
Para la propagación clonal de Pinus pinaster se han abordado ensayos previos de ES. No obstante, e independientemente de las diferentes procedencias y familias utilizadas en estos estudios, la baja tasa de embriones maduros obtenidos sigue siendo el mayor hándicap para la aplicación de esta técnica a gran escala. Además de la selección de genotipos de élite, estos estudios han permitido la identificación de genes posibles candidatos a regular características relacionadas con respuestas adaptativas a estrés hídrico y crecimiento. La validación de esos genes requiere de la disponibilidad de protocolos eficaces de transformación genética.
Protocolos de Maduración y Regeneración
Se han optimizado los protocolos para la maduración del callo embriogénico de Pinus pinaster y se han comparado con un protocolo convencional. Como protocolo convencional, el tejido vegetal disgregado en medio líquido se cultiva sobre papel Whatman durante tres meses en medio de maduración, compuesto de medio de Litvay con 60 g/l de sacarosa y 80 µM de ácido abscísico (ABA).
Se estudió el efecto del medio líquido, la desecación, la presencia de carbono activo (CA) y el período de cultivo con ABA. El cultivo en medio líquido provocó un sobrecrecimiento del callo que generó un estrés celular perjudicial para el proceso. Así mismo, la desecación afectó negativamente la maduración del callo embriogénico. La reducción del período de incubación con ABA, de tres meses a un mes, y la adición de CA favorecieron la obtención de embriones en los estadios precotiledonares, pero no fue determinante en la obtención de embriones en estadios cotiledonares. En un experimento posterior, se probó el efecto de cuatro soportes diferentes para el cultivo del callo embriogénico: filtro de acetato de celulosa, filtro de nylon, filtro de poliéster y papel Whatman. El papel Whatman favoreció la maduración en la mayoría de las líneas.
Los embriones obtenidos de estos experimentos se cultivaron en medio de germinación (medio mLV sin reguladores y con 30 g/l de sacarosa), almacenándolos durante tres semanas en frío (4ºC) y oscuridad. Posteriormente, se colocaron en ángulo de 40º a 25 ± 2ºC, manteniéndolos durante 14 días en oscuridad, y finalmente las placas se situaron bajo un fotoperíodo de 16 horas. Las plántulas obtenidas se transfirieron a alvéolos cubiertos con plástico transparente con un sustrato compuesto de turba y perlita para su aclimatación y posterior paso a invernadero.
Avances en Micropropagación
Se ha obtenido un protocolo mejorado de micropropagación vía caulogénesis adventicia directa a partir de cotiledones aislados de pino marítimo. El protocolo aumenta la supervivencia de los cotiledones desde un 65% a más del 80%. Se reducen los tiempos de cultivo, eliminando el período de germinación de los embriones (8 días) previo a la inducción y acortando el período de inducción caulogénica de 21 a 14 días. Además, incrementa el porcentaje de enraizamiento de un 60 a un 86% y disminuye la duración de esta fase a cinco semanas.
También se ha obtenido un protocolo de micropropagación vía embriogénesis somática a partir de embriones cigóticos inmaduros de pino marítimo de procedencia asturiana. Se ha determinado el período estacional durante el que es posible la inducción embriogénica, así como aquellos genotipos de entre los ensayados que responden mejor, lo que permitirá ahorrar tiempo y trabajo en futuras inducciones. Además, se ha optimizado el proceso de maduración (cuello de botella del proceso embriogénico), incrementando el número de embriones maduros obtenidos más de un 25%. Por otro lado, se ha desarrollado un protocolo eficiente de crioconservación que permite la recuperación de todos los genotipos ensayados.
Transformación Genética del Pino Marítimo
La embriogénesis somática, además de una importante vía de propagación clonal, proporciona un material idóneo para la transformación genética. Esta última vía abre un abanico de posibilidades para la mejora genética y la validación y caracterización de genes candidatos. Por este motivo, se ha optimizado un protocolo de transformación genética de masas embriogénicas mediado por Agrobacterium tumefaciens. El éxito de la infección se midió mediante la expresión transitoria del gen gusA.
Optimización del Cocultivo con Agrobacterium tumefaciens
En Pinus pinaster, se ha ensayado el efecto del tiempo de infección, la concentración bacteriana, el método de transformación (vacío vs. sonicación), la cepa bacteriana y los plásmidos sobre la expresión transitoria del gen gusA. La densidad óptica bacteriana de 0.7 y la aplicación de 10 minutos de infección, incluyendo 1 minuto de vacío, y la utilización de la cepa AGL1 con el plásmido pTAB16 se han mostrado como las más óptimas para la infección. Además, se ha determinado la concentración de agentes selectivos que inhiben el crecimiento de tejido no transformado de P. pinaster para una posterior selección de líneas transformadas. En P. pinaster, 2 mg/l de PPT y 5 mg/l de kanamicina han sido suficientes para inhibir el crecimiento. Es importante señalar que, hasta el momento, solo existen dos trabajos de transformación genética en pino marítimo, utilizando higromicina como agente selectivo, y solo uno de ellos ha logrado obtener planta transgénica.
Clonación y Caracterización de Genes
En trabajos previos en nuestro laboratorio se identificaron dos secuencias expresadas diferencialmente durante la inducción caulogénica que muestran homología, una con los Reguladores de Respuesta tipo A y la otra con el gen CLAVATA1 de Arabidopsis. Mediante las técnicas RACE y paseo cromosómico, se ha clonado la secuencia completa de ambos genes en pino marítimo (PipsRR1 y PipsCLV1L, Genbank JQ801609 y HQ37727 respectivamente). Se ha estudiado la expresión diferencial de ambos genes durante el proceso de inducción caulogénica en cotiledones escindidos de pino marítimo. Los resultados muestran que ambos genes se encuentran sobre-expresados durante los primeros momentos de la inducción para posteriormente disminuir hasta niveles basales a los seis días, lo que sugiere un papel en la caulogénesis adventicia en coníferas.
Para profundizar en su estudio, se clonó un fragmento de aproximadamente 1.500 pb aguas arriba de la región 5’ del gen y se construyó un plásmido binario (uno para cada gen) basado en el sistema Gateway®, donde la región promotora del gen dirige la expresión de una proteína de fusión de GFP:GUS. Estas construcciones se transformaron genéticamente en masas embriogénicas de pino marítimo, analizando 24 eventos de transformación independientes para cada una. Los resultados moleculares confirmaron la incorporación del transgén en el genoma vegetal para todos los eventos. Los resultados histoquímicos también mostraron actividad β-glucuronidasa en todas las líneas, demostrando la expresión del gen y la funcionalidad de las construcciones. Se ha analizado la expresión de los genes, mediante actividad β-glucuronidasa, durante la proliferación de la masa embriogénica transformada, así como en diferentes puntos del proceso de maduración.
Respuesta Adaptativa y Tolerancia al Estrés en *Pinus pinaster*
El incremento de los estreses ambientales y la alteración en su incidencia estacional, ambos fenómenos asociados al cambio climático, están teniendo efectos significativos sobre la fisiología, fenología y distribución de las especies forestales. En este contexto, las especies con tiempos de generación largos, como las coníferas, presentan limitaciones para adaptarse a ambientes cambiantes a través de mecanismos evolutivos clásicos. Por ello, el desarrollo de herramientas biotecnológicas es de gran ayuda para generar variedades con una mejor adaptabilidad al ambiente cambiante.
Explorar estrategias como la variación de la temperatura y la disponibilidad de agua durante la ES podría allanar el camino para obtener plantas mejor adaptadas a los desafíos del cambio climático. Se ha demostrado que la aplicación de termo-priming durante la fase de inducción de la ES produce marcas epigenéticas que se traducen en una mayor tolerancia posterior a estrés térmico y tolerancia cruzada a estrés hídrico de las plantas somáticas generadas, mostrando la sinergia entre ambos factores.
RedBosques Clima | Los bosques ante el cambio climático (subtítulos en español)
Mecanismos de Aclimatación y Memoria Epigenética
Este acondicionamiento se manifiesta tanto a nivel de expresión génica, con una regulación diferencial de genes implicados en la respuesta a estrés, como a nivel fisiológico, evidenciado en un mejor rendimiento fotosintético, ajuste osmótico y menor daño oxidativo en condiciones de estrés. Además, la variación de la temperatura durante la fase de maduración de los embriones somáticos da lugar a plantas mejor adaptadas a episodios de calor extremos, indicando que incluso tratamientos aplicados en fases tardías del desarrollo embriogénico pueden tener un impacto significativo sobre la capacidad adaptativa del fenotipo resultante.
A nivel molecular, se ha evidenciado que estos cambios podrían estar mediados por mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN, la modificación de histonas y posiblemente la acción de ARN pequeños, implicados en el establecimiento de una memoria de estrés a largo plazo. Los estudios realizados han permitido identificar conjuntos de genes que podrían estar relacionados con la maquinaria epigenética responsable de dicha memoria. En conjunto, este trabajo proporciona evidencias claras de que la variación en las condiciones de cultivo durante la ES puede ser utilizada como una herramienta eficaz para inducir memoria epigenética y mejorar la resiliencia de las plantas somáticas generadas frente a factores de estrés abiótico como el calor y la sequía.
Se ha demostrado que es posible generar epitipos, plantas derivadas de una misma línea celular con diferentes perfiles epigenéticos, capaces de soportar mejor la exposición frente a condiciones climáticas cambiantes. Estas plantas podrían utilizarse en programas piloto de reforestación en entornos degradados o sometidos a estrés, contribuyendo a la conservación de masas forestales y a la mitigación de los efectos del cambio climático.
- Pérez-Oliver, M.A.; Haro, J.G.; Pavlovi´c, I.; Novák, O.; Segura, J.; Sales, E.; Arrillaga, I. Priming Maritime Pine Megagametophytes during Somatic Embryogenesis Improved Plant Adaptation to Heat Stress. Plants 2021, 10, 446.
- Pérez-Oliver, M.A.; González-Mas, M.d.C.; Renau-Morata, B.; Arrillaga, I.; Sales, E. Heat-Priming during Somatic Embryogenesis Increased Resilience to Drought Stress in the Generated Maritime Pine (Pinus pinaster) Plants. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 9299.
- Montero-Pau, J.; Pérez-Oliver, M.A.; Rodríguez-Cuesta, Á.; Arrillaga, I.; Sales, E. Temperature-induced variation in the transcriptome of maritime pine (Pinus pinaster Ait.) embryogenic masses modulates the phenotype of the derived plants. BMC Genomics. 2025, 26, 467.
Diversidad Genética y Estrategias de Conservación
El pino marítimo (pino negral, rodeno o resinero) es una conífera ampliamente distribuida en la cuenca del Mediterráneo occidental (Europa del Sur y África) y la costa Atlántica de Portugal, España y Francia. En este trabajo se analiza la distribución geográfica de la diversidad genética de Pinus pinaster tanto a escala molecular (isoenzimas) como cuantitativa (altura total, forma del fuste y supervivencia), con especial referencia al ámbito noroccidental de la especie.
A escala regional, se distinguen tres grupos de poblaciones claramente diferenciados: grupo Noroeste, grupo Sureste y grupo Este, concentrándose la mayor parte de la diversidad y riqueza alélica en los dos últimos. Existe una mayor diversidad genética en las poblaciones cercanas a la costa Mediterránea, reduciéndose la misma según nos aproximamos al noroeste peninsular. Dicha estructura puede explicarse mediante la existencia de refugios glaciares de la especie en zonas próximas a la costa, hoy ocupadas por poblaciones marginales de gran singularidad y riqueza alélica. La variación genética cuantitativa está relacionada de forma muy débil con la variación molecular, indicando la gran importancia de la selección natural en el proceso de diferenciación y adaptación de esta especie a la gran variación ecológica de las estaciones que ocupa.
Con respecto al análisis de la estructura genética local, se ha encontrado una autocorrelación positiva de los alelos en el regenerado en clases de distancia menores de 15 m, que puede ser explicada por una dispersión restringida de la semilla. Dicha correlación no se mantiene en la población adulta, a pesar de presentar esta una estructura familiar similar a la del regenerado. El pino negral presenta un sistema reproductor con una elevada tasa de polinización cruzada, próxima al 100%, y un elevado flujo genético tanto regional (Nem = 5,36) como local (flujo genético por semilla: 56 ± 8%; flujo genético por polen: 85 ± 13%). Además, existe una relación positiva entre el éxito reproductor individual y el perímetro del tronco a 1,30 m de los parentales femeninos.
La existencia de flujo genético local condiciona las estrategias de conservación y mejora de recursos genéticos de P. pinaster. El elevado flujo genético detectado indica el peligro potencial de contaminación polínica en las masas naturales, especialmente aquellas de alto valor fitogeográfico, desde repoblaciones de origen no local. Con respecto a la estrategia de mejora de la especie, una baja cantidad de flujo genético puede producir una notable reducción en la ganancia genética obtenida tras la selección fenotípica de los árboles padre en un huerto clonal.
Líneas de Investigación y Logros en la Mejora del Pino Marítimo
La investigación se ha centrado en el desarrollo de herramientas biotecnológicas para la propagación y mejora de Pinus pinaster Aiton (pino marítimo). Esta investigación ha sido subvencionada por el Ministerio de Ciencia e Innovación.
Los resultados de estos proyectos destacan:
- La selección de familias de Pinus pinaster de procedencias atlántica, continental y mediterránea, con elevada capacidad embriogénica.
- La creación de un banco de germoplasma con estas líneas.
- La elaboración de protocolos de transformación genética en pino marítimo.
Se estudiará el potencial de los sistemas embriogénicos, establecidos en esta especie, como herramienta para obtener genotipos tolerantes a estrés. Se abordarán dos estrategias: una aprovecha la variabilidad natural y la segunda pretende inducir memoria epigenética aplicando tratamientos de estrés durante las fases de proliferación-maduración. El proyecto también abordará varios aspectos fisiológicos y moleculares del proceso embriogénico como estrategia para mejorar las fases de inducción y maduración.
Asimismo, se estudiará la posible relación entre los niveles hormonales endógenos (ABA e IAA) y la metilación del ADN con la capacidad de maduración de las líneas embriogénicas en pino marítimo.
