Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd ex Mart., comúnmente conocida en Paraguay como "mbokaja", es una palmera que se distribuye a lo largo de América tropical y subtropical. Es nativa de la vegetación de Paraguay y Brasil (Sorol et al., 2012; Chorfi, 2013). Esta especie es valorada por ser alimento para animales domésticos y sustento familiar, proporcionando ingresos por la venta de frutos de los que se extrae aceite para la elaboración de jabones. Además, sus troncos partidos se utilizan en la construcción de techos y paredes, y la almendra se comercializa, triturada o no, para uso gastronómico.
Entre sus diversos usos, destaca el aceite extraído tanto de la almendra (55% a 60%) como de la pulpa (4% a 5% de la fruta), siendo de gran importancia para la industria aceitera (IICA, 2007; Ganduglia et al., 2009). Paraguay tiene un potencial significativo para convertirse en productor y exportador de biocombustibles debido a sus características agropecuarias y forestales, así como a su clima y suelo favorables para la producción de este cultivo (Bohn, 2009). Las condiciones locales, incluyendo clima, suelo, mano de obra y tierra disponible, favorecen su cultivo, obteniendo buenos rendimientos y posicionándola como materia prima en la generación de combustibles de origen biológico. Souto (2008) reporta que del fruto se pueden extraer aproximadamente 4000 litros de aceite por hectárea, una producción mucho mayor en comparación con otros cultivos aceiteros como el aguacate (Persea americana), ricino (Ricinus communis), colza (Brassica napus), maní (Arrachis hipogeae), girasol (Helianthus annuus), tung (Aleurites fordii) y soja (Glicine max).
Problemas de Germinación y la Propagación in vitro
A pesar de su potencial, Acrocomia aculeata presenta problemas de germinación en sus semillas debido a la lentitud, el bajo porcentaje y, en muchos casos, la pérdida de viabilidad por deshidratación. Este fenómeno se conoce como latencia y es un factor limitante y restrictivo en la producción del rubro (Schmidt, 2008). Una solución viable y útil, que no requiere grandes inversiones ni múltiples gastos, es el método de propagación in vitro. Esta técnica consiste en aislar una porción de la planta y proporcionarle las condiciones físicas y químicas necesarias para su desarrollo (CIAT, 1991).
El proceso de enraizamiento es uno de los eventos fisiológicos más importantes durante el cultivo in vitro, ya que determinará el establecimiento de las plantas en el invernadero y, posteriormente, en campo. El inicio del desarrollo de la semilla, que sirve como anclaje y medio para la absorción de agua y nutrientes, es la emergencia de la radícula. Este proceso está definido por reguladores de crecimiento, generalmente auxinas, que se encuentran de manera endógena en los vegetales (Bidwell, 1993; Azcón-Bieto & Talón, 2000).
Objetivos del Estudio de Desarrollo Radicular
El objetivo principal de este trabajo fue evaluar el desarrollo radicular de embriones cigóticos de Acrocomia aculeata (mbokaja) en cultivo in vitro utilizando diferentes medios de cultivo y tiempos de subcultivo. También se evaluó el efecto del carbón activado adicionado al medio de cultivo MS y el efecto de la luz en la incubación en la germinación in vitro de embriones cigóticos de mbokaja.
Materiales y Métodos
Ubicación y Período Experimental
El proceso experimental se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Asunción, en la ciudad de San Lorenzo, Paraguay, entre los meses de junio y agosto del 2012. Un estudio adicional sobre embriogénesis cigótica se realizó entre febrero y marzo del 2014 en la misma ubicación.
Material Vegetal y Recolección
Se utilizaron embriones originarios de frutos maduros de A. aculeata como fuente de explantes para el cultivo in vitro. Estos frutos fueron colectados entre febrero y marzo de 2012 de una finca en San Lorenzo, Departamento Central, donde se seleccionaron cinco plantas madres con mayor fructificación. De cada planta madre se cosecharon 10 frutos, totalizando 50, los cuales se mezclaron para su posterior secado a temperatura ambiente durante 20 días para eliminar el pericarpio. Para otro estudio, los frutos se cosecharon de cuatro plantas adultas de poblaciones naturales en Mojón de Fierro, provincia de Formosa, en diciembre de 2010. Para el estudio morfoanatómico, los frutos se recolectaron de 10 individuos de una población nativa cerca de San Lorenzo, Departamento Central, Paraguay, entre febrero y marzo de 2014, recolectando 20 frutos por racimo por planta, sumando un total de 100 frutos por individuo.
Procesamiento de Almendras y Extracción de Embriones
Tras la eliminación del pericarpio, se rompió el endocarpo con una prensa manual para liberar las almendras (semillas) que contenían los embriones cigóticos. Las almendras dañadas o afectadas por lesiones mecánicas, infecciones fúngicas, bacterianas o ataques de insectos fueron eliminadas por bioseguridad.
La esterilización de materiales como placas de Petri, mangos de bisturí, pinzas de punta fina, agua destilada y frascos se realizó en autoclave a 121°C y 1 atmósfera de presión durante 50 minutos.
Desinfestación de Almendras
Previo a la escisión, las almendras se sometieron a dos etapas de desinfestación:
- Inmersión en una solución de alcohol al 90% durante 4 minutos, con suaves agitaciones. Para otro estudio, se utilizó una solución al 1% de lavandina comercial (hipoclorito de sodio al 5%) durante 24 horas.
- Desinfestación en una solución de 20% de hipoclorito de sodio durante 20 minutos, con suaves agitaciones. Para otro estudio, en cabina de flujo laminar, se utilizó una solución de etanol al 70% durante 2 minutos, seguida de una solución al 2% de lavandina comercial (hipoclorito de sodio al 5%) más dos gotas de Tween 20, durante 20 minutos en agitación.
Después de la segunda etapa, se realizó un triple enjuague de las almendras con agua destilada esterilizada para eliminar restos de soluciones. Todo el proceso de desinfestación se llevó a cabo dentro de la cámara de flujo laminar para asegurar la bioasepsia. Las almendras desinfestadas se depositaron en cajas de Petri esterilizadas.
Escisión de Embriones
Con la ayuda de un bisturí y pinzas de punta fina, se realizaron dos incisiones a ambos lados de la almendra, en la zona media, tomando como referencia el punto de inserción levemente prominente del embrión. Al realizar la segunda incisión, se aplicó una leve torsión para facilitar la fisión de la almendra y extraer el embrión. Los embriones extraídos se cultivaron cuidadosamente con un bisturí para su posterior inclusión en bloques de resina, para el estudio morfoanatómico.
Cultivo y Tratamientos
Inicialmente, para la germinación, los embriones extraídos fueron cultivados en un primer medio con carbón activado (CA) a razón de 2 g/L y se sometieron a oscuridad inicial durante 20 días para suprimir la oxidación de los explantes. Posteriormente, se expusieron a un fotoperiodo constante de 16 horas de luz en la sala de crecimiento a 25°C. En otro estudio, los embriones maduros fueron inoculados horizontalmente en tubos de ensayo con 15 ml de medio MS (Murashige y Skoog, 1962), complementado con 100 mg L-1 de myo-inositol, vitaminas, y MS con (0.1; 3 y 5 g.L-1) de carbón activado, 3% de sacarosa. El pH del medio se ajustó a 5.8 ± 0.1 y 7 g/l de agar antes de la esterilización en autoclave a 121 °C y 1 atm durante 20 minutos.
Una vez germinados, los embriones fueron subcultivados y sometidos a cinco tratamientos:
- T1: Medios MS suplementados con 1 ppm de BAP (bencilaminopurina).
- T2: Medios MS + 2 ppm de BAP.
- T3: Medios MS + 4 ppm de BAP.
- T4: Medios MS + 2 g/L de CA.
- T5: Medios MS sin concentraciones de BAP ni CA.
Estos fueron expuestos a un fotoperiodo constante de 16 horas de luz. En otro estudio, los tratamientos consistieron en la combinación de 2 regímenes de incubación de los explantes en sala de crecimiento, con temperatura de 27 ºC ± 2 ºC, con ambiente oscuro durante 14 días desde el inicio del cultivo, y el otro, con un fotoperiodo de 16 h luz con una irradiación de 42 μmol x m-2 s-1, con 4 tratamientos, 3 con carbón activado (1, 3, 5 g.L-1) y MS solo. Después de 14 días, los explantes mantenidos en oscuridad pasaron a las condiciones de luz.
Fertilizacion in vitro con cultivo de embriones
Población y Tamaño de Muestra
Se utilizaron 50 frutos, de los cuales se extrajeron al azar 45 embriones cigóticos para el cultivo in vitro. Cada repetición estuvo compuesta por 3 embriones cultivados en frascos individuales, basándose en estudios previos de Schmidt (2008) y González (2010). Estos embriones enfrentaron en gran medida la oxidación y la presencia de estructuras aéreas y radiculares indiferenciadas. Se destacó la contaminación masiva de embriones, lo que, según Rocha (2002), ocasiona una pérdida total de los explantes cultivados in vitro. Los frutos no utilizados se guardaron como reserva.
Variables y Diseño Experimental
La variable analizada fue la longitud de las raíces generadas por los embriones cigóticos sembrados in vitro, evaluada a los 20 y 40 días posteriores al subcultivo. La medición se realizó con una regla milimetrada, expresando los valores en centímetros. Las evaluaciones se hicieron después de veinte días de la siembra de los embriones cigóticos en el primer medio de cultivo con CA a razón de 2 g/L, para suprimir la oxidación, antes de ser subcultivados en los diferentes tratamientos.
El estudio se basó en un diseño completamente al azar, con cinco tratamientos y tres repeticiones. Para la normalidad de la distribución de datos se aplicaron las pruebas de Shapiro-Wilk; para observar los efectos entre tratamientos, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis; y para las diferencias entre comparaciones pareadas, la prueba de Mann-Whitney. Se empleó un nivel de significancia de (p<0.005) en todos los procedimientos descritos. Las operaciones estadísticas se realizaron con el software PAST3. En otro estudio, se utilizó el software estadístico InfoStat, versión 2004, con 3 repeticiones por tratamiento y 10 embriones por repetición, y las observaciones se realizaron a los 60 días del cultivo.
Resultados
Los embriones cultivados inicialmente en medio con CA (2 g/L) durante 20 días fueron transferidos a frascos con medios enriquecidos con BAP (1, 2 y 4 ppm), CA (2 g/L) y MS. Después de 20 días, no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos. El test de Shapiro-Wilk (p>0.005) indicó que los datos no seguían una distribución normal, por lo que se aplicó Kruskal-Wallis para las mediciones a los 20 y 40 días post-subcultivo, confirmando la ausencia de diferencias significativas (p=0.129>0.005 y p=0.067>0.005 respectivamente).
La prueba de Mann-Whitney (Tabla 1) tampoco mostró diferencias entre las comparaciones pareadas tras 20 días de incubación con fotoperiodo constante de 16 horas luz, lo que significa que ninguna dosis de BAP resultó significativa. Sin embargo, las dosis de CA (2g/L) lograron suprimir la oxidación en los explantes en ambos períodos de incubación, facilitando el desarrollo de todos los embriones cultivados.
En cuanto a las medias, los tratamientos 1 (1 ppm de BAP) y 4 (2 g/L CA) mostraron las mejores respuestas con medias de 4.66 cm y 3.33 cm, respectivamente (Figura 1). Después de 40 días de incubación con fotoperiodo constante de 16 horas luz, se observó un leve aumento en la longitud de las raíces en los mismos tratamientos: 6 cm para el tratamiento 1 (1 ppm de BAP) y 5 cm para el tratamiento 4 (2 g/L de CA) (Figura 2). En el tratamiento 2 (2 ppm de BAP) no se obtuvieron datos ya que no generó respuesta alguna. La tabla 2 confirmó que estos resultados no mostraron diferencias significativas entre tratamientos después de 40 días.
En otro estudio, a los 60 días de cultivo con un fotoperiodo de 16 horas luz, el medio MS solo mostró una germinación del 53.3% de los embriones. Los mejores porcentajes (93.3%) se observaron en MS más 3 g.L-1 de carbón activado (Figura 1 del otro estudio). No se observaron diferencias significativas (p<= 0.05) entre los 3 tratamientos con MS y 1, 3 o 5 g.L-1 de carbón activado, pero sí al compararlos con MS sin CA.
Discusión
Efecto del Carbón Activado
Uno de los principales beneficios del carbón activado (CA) en los medios de cultivo es la supresión de la oxidación, actuando como soporte catalítico en la oxidación del fenol. Las condiciones de oscuridad inicial también suprimen rutas metabólicas de ciertos compuestos, como el ciclo shikímico (Quiñones et al., 2012), que es dependiente de la luz y del cual derivan compuestos fenólicos. La oxidación de estos compuestos puede convertirlos en quinonas muy reactivas, capaces de necrosar los tejidos y causar muerte celular (Cáceres, 2004; Rugna et al., 2007; Villegas et al., 2008, mencionados en González, 2010).
Azofeifa (2009) atribuye el efecto benéfico del CA a su capacidad para remover sustancias inhibitorias o tóxicas del medio de cultivo, ya sean producidas durante el autoclavado o liberadas por el explante. Entre las sustancias producidas durante el autoclavado, se ha reportado la presencia del 5-(hidroximetil)-2-furaldehído (HMF), un compuesto inhibitorio que se forma a partir de la fructosa o por hidrólisis de sacarosa. El uso de CA es frecuente, especialmente en especies de la familia Arecaceae, donde problemas de oxidación son comunes. Las concentraciones de CA utilizadas en la literatura varían entre 0.5 y 10 g/L, siendo las más comunes de 2.0 y 3.0 g/L. Además, la incorporación de 2g/L de CA contribuye a las condiciones de oscuridad, ya que las moléculas carbonosas son inherentemente oscuras (Schmidt, 2008).
Los datos obtenidos en la germinación de embriones cigóticos in vitro concuerdan parcialmente con los de Bandeira (2008), quien evaluó el régimen de incubación y el CA en embriones de Acrocomia aculeata. Bandeira concluyó que el fotoperiodo de 16 horas proporciona mayores índices de oxidación en comparación con una oscuridad inicial de 30 días. En el presente trabajo, no existieron diferencias significativas entre las incubaciones utilizadas (93.3% con fotoperiodo de 16 h y 80% con 14 días de oscuridad), coincidiendo en que el medio MS con 3 g.L-1 de CA ofrece mayores porcentajes de germinación y que al aumentar el CA en el medio, disminuyen los explantes oxidados. Los resultados de germinación de embriones cigóticos son superiores a los de Silva et al. (2008), que lograron solo un 33% de tasa germinativa sin CA y con 16 horas de fotoperiodo. En contraste, Soares et al. (2008) obtuvieron un 95.6% de germinación con 16 horas de fotoperiodo, y Fogaça et al. (2009) lograron un 78% con la adición de ácido 2-naftalenacético (ANA) y benciladenina (BA) en concentraciones de 1.0 mg.L-1 y 0.5 mg.L-1 respectivamente.
Desarrollo Radicular y Enraizamiento
La adición de CA en los medios de cultivo MS ayuda a promover un enraizamiento efectivo de embriones, coincidiendo con los trabajos de Rodríguez et al. (1997) en embriones maduros de Persea americana Mill. Pedroza (2009) también sostiene que el CA incide positivamente en el desarrollo radicular, caulinar y foliar en protocormos de Epidendrum elongatum Jacq. cultivados in vitro. Rache & Pacheco (2010) sugieren que es posible suprimir el uso de reguladores de crecimiento utilizando concentraciones cercanas a los 3 g/L de CA para el enraizamiento, basándose en sus experiencias con Vaccinium meridionale.
Sustancias como carbohidratos, proteínas y lípidos nutren el crecimiento del eje embrionario hasta que la plántula desarrolla un sistema radical capaz de absorber nutrientes (Moreira & Nakagawa, 1988). En monocotiledóneas, la movilización y degradación de sustancias de reserva está controlada por el embrión (Mantilla, 2000). La germinación se inicia con la emergencia de la radícula, el evento final del proceso de iniciación (Besnier, 1989). El embrión consta de un eje, el hipocotilo, con el meristemo radical en un extremo y el cotiledón o cotiledones y el meristemo del primer brote en el otro (Esau, 1985).
Es relevante que el inicio y desarrollo radicular no fue inducido exógenamente por auxinas, aunque su presencia endógena y la interacción con las concentraciones de BAP y CA pudieron haber generado este inicio. Esto coincide con los trabajos de Borges et al. (2011) en la optimización de medios de cultivo para plantas micropropagadas de Dioscorea alata L., y con los de Zárate et al. (1997) en la regeneración de Echinospartum algibicum. Estos mismos autores también obtuvieron enraizamiento en medios con BAP en sus trabajos de inducción de brotes múltiples con Atropa baetica, atribuyendo un efecto residual del BAP. Efectos similares atribuidos al poder residual del BAP en el desarrollo in vitro de meristemas de Banano Williams fueron mencionados por Ortega et al. (2012). El poder residual del BAP no afecta la capacidad de enraizamiento de los explantes, sino que la favorece, como se observó en los embriones cigóticos de A. aculeata después de 40 días de exposición a fotoperiodo constante de 16 horas de luz. Domínguez et al. (2008) propusieron la misma afirmación al notar efectos similares en agaves mexicanos expuestos a BAP.
Las citoquininas, como el BAP, son fitohormonas que juegan un papel importante en el crecimiento y desarrollo de la planta, y su actividad en la morfogénesis y el metabolismo es muy dependiente de factores ambientales (Francescangeli & Zagabria, 2010). Mogollón et al. (2004) sostienen que una menor incorporación de auxinas y una mayor concentración de citoquininas (BAP en este caso) resultan positivas para el desarrollo de órganos esenciales, incluidas las raíces, en los explantes.
Conclusiones
La germinación in vitro de embriones cigóticos de mbokaja es superior en el medio MS suplementado con 3 g.L-1 de carbón activado, incubados con un fotoperiodo de 16 horas. La propagación in vitro de mbokaja, a través del cultivo de embriones cigóticos, demuestra ser eficaz para la obtención de plántulas. No existieron efectos significativos en los tratamientos con BAP, aunque el CA suprimió la oxidación en los explantes. Los mejores resultados en longitud radicular después de 40 días de incubación se presentaron en los tratamientos 1 (MS+1 ppm de BAP) con 6 cm y 4 (MS+CA 2g/L) con 5 cm.