El desarrollo tecnológico que ha alcanzado el ser humano es apabullante, sobre todo si tenemos presente que nuestro punto de partida ha sido la ausencia total de tecnología. Sin embargo, pese a este indiscutible logro en muchos ámbitos de la ciencia, nuestra ignorancia supera con creces lo que sabemos. En este ámbito, la perseverancia y el esfuerzo son las mejores herramientas de las que disponen los investigadores en general, y en particular aquellos que se esmeran para entender cómo funciona la gastrulación.
Este término intimida un poco, pero, en realidad, es una idea más sencilla de lo que parece. Si nos detenemos un momento y lo pensamos bien, resulta sorprendente que la alianza de apenas unas pocas células sea capaz de desencadenar los mecanismos que dan lugar a la formación de un ser vivo extremadamente complejo.
Investigación Avanzada en Gastrulación
Tres equipos de investigadores de la Universidad de Harvard (EE. UU.), la Universidad de California en San Diego (EE. UU.) y la Universidad de Dundee (Escocia) han ideado una estrategia ingeniosa para afrontar este reto. Los embriones de pollo son muy similares a los embriones humanos en la fase temprana en la que se produce la gastrulación, por lo que son candidatos idóneos para estudiar a fondo este fenómeno. Los físicos de la Universidad de California en San Diego han implementado un modelo matemático capaz de identificar patrones en sistemas biológicos complejos empleando la información que han recabado los biólogos de la Universidad de Dundee.
Hasta ahora no se podía predecir este fenómeno observando un embrión, por lo que estos investigadores han utilizado la capacidad predictiva del modelo matemático que han diseñado para estudiar cómo se produce la gastrulación a partir de condiciones iniciales muy diferentes. Cabía la posibilidad de que este resultado fuese solamente una predicción fallida del modelo matemático, así que optaron por ponerlo a prueba experimentalmente, sometiendo a los embriones de pollo en sus primeras etapas de desarrollo exactamente a las mismas condiciones iniciales que introdujeron en el modelo.
El Embrión de Pollo como Modelo Experimental
Se describe un método para realizar experimentos de ganancia y pérdida de función en embriones de pollo tempranos. El embrión de pollo se ha utilizado como modelo embriológico clásico para estudiar eventos de desarrollo debido a su fácil disponibilidad, similitud con los embriones humanos y facilidad para manipulaciones embriológicas y quirúrgicas. Sin embargo, con la llegada de la era molecular, los embriones de aves presentaron claras limitaciones experimentales, en gran parte debido a la dificultad de realizar mutagénesis dirigida o estudios transgénicos.
No obstante, en la última década y media, se han desarrollado una serie de nuevos métodos de transgénesis transitoria que permiten la alteración eficiente de la función genética durante el desarrollo embrionario temprano. Estas técnicas han permitido estudiar los efectos de la inactivación o sobreexpresión de genes en la regulación transcripcional posterior, así como en los derivados embrionarios. Esto, junto con la secuenciación del genoma del pollo, ha permitido que el embrión de pollo entre en la era genómica.
Si bien los intentos de establecer la transgénesis de la línea germinal están en curso, los métodos para alteraciones genéticas rápidas y transitorias dirigidas espaciotemporalmente han restablecido nuevamente al embrión de pollo como un nicho experimental importante al hacer posible aplicar la genética en conjunto con las técnicas embriológicas clásicas. Esto proporciona una herramienta única para explorar el papel de genes importantes para el desarrollo (Ishii y Mikawa, 2005; Itasaki et al., 1999; Krull, 2004; Ogura, 2002; Swartz et al., 2001).
Técnicas de Transgénesis y Manipulación Genética
Los métodos de transfección transitoria han permitido una expresión errónea y sobreexpresión eficiente de transgenes. Para análisis a largo plazo, la transferencia de genes mediada por retrovirus tiene una ventaja particular. Para experimentos a corto plazo, los métodos de electroporación y transferencia de genes mediada por adenovirus proporcionan una expresión transitoria, en gran parte debido al corto tiempo de persistencia del transgén dentro de la célula.
Más recientemente, se han empleado construcciones mediadas por transposones Tol2, lo que permite la integración en el genoma y la expresión prolongada del transgén (Sato et al., 2007). Hoy en día, estos métodos se utilizan habitualmente para análisis de ganancia de función, para sobreexpresar o expresar ectópicamente genes de interés (Arber et al., 1999; Barembaum y Bronner-Fraser, 2007; Bel-Vialar et al., 2002).
Los experimentos de pérdida de función también son posibles utilizando electroporación de construcciones dominantes negativas que actúan como inhibidores competitivos (Bel-Vialar et al., 2002; Renzi et al., 2000; Suzuki-Hirano et al., 2005), oligos de morfolino antisentido (Basch et al., 2006; Kos et al., 2001; Sheng et al., 2003) que bloquean la traducción o el empalme, o construcciones que expresan pequeños ARN de interferencia o de pequeña horquilla (siRNA o shRNA) (Chesnutt y Niswander, 2004; Das et al., 2006; Katahira y Nakamura, 2003).
La Electroporación como Método Clave
La electroporación es el método más popular de transfección transitoria en embriones de pollo. La electroporación de embriones de pollo implica la aplicación de un campo eléctrico al tejido expuesto que altera transitoriamente la estabilidad de la membrana plasmática celular, creando poros reversibles a través de los cuales los ácidos nucleicos o sus análogos pueden transportarse fácilmente al citosol.
El uso de este método para la transfección en embriones de vertebrados se ha facilitado adaptando los parámetros de voltaje y el tipo y duración del pulso eléctrico. Al aplicar varios pulsos cuadrados sucesivos a un voltaje muy bajo, con largos períodos de descanso entre ellos, se puede administrar con éxito una construcción de ADN u otra pequeña partícula cargada al citoplasma, con una muerte celular mínima, una alta eficiencia de absorción y una buena tasa de supervivencia embrionaria. Aún no se conoce el límite de tamaño de la molécula de ADN que puede transfectarse de esa manera, aunque es más probable que la limitación de tamaño en este procedimiento (si la hay) resida en los problemas prácticos de clonar fragmentos grandes en el plásmido.
Epigenética: Más Allá del ADN
El Dr. Pablo Hernán Strobl-Mazzulla, investigador adjunto del CONICET y director del Laboratorio de Biología del Desarrollo en el Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico de Chascomús (IIB-INTECH, CONICET-UNSAM), señala la importancia de la epigenética. El término ha sido acuñado por Conrad Weddington en 1942, aunque sólo cobró una mayor relevancia en los últimos años. Actualmente se define como el estudio de las modificaciones en la expresión de genes que no alteran la secuencia del ADN y que son hereditarios. Sin embargo, hoy en día el concepto se usa en un sentido más amplio y no siempre implica la heredabilidad de los cambios.
En los últimos años, diversas investigaciones han demostrado que la herencia génica no es un proceso gobernado por programas predeterminados que simplemente pasan de una generación a la siguiente. Actualmente tenemos varias líneas de investigación destinadas a entender los mecanismos epigenéticos implicados en la especificación y diferenciación celular de tejidos como el sistema nervioso central, las células de la cresta neural y sus derivados (huesos cráneo-faciales y ganglios del sistema nervioso periférico, entre otros) y el desarrollo del oído interno.
El Embrión de Pollo en la Investigación Epigenética
Se utilizan embriones de pollo como modelo de estudio debido a que presenta una gran cantidad de ventajas. Primeramente, existe un gran número de herramientas tanto a nivel molecular -genoma casi completamente secuenciado-, así como también embriológicas que permiten una fácil manipulación de los diferentes estadios del desarrollo. A su vez, los embriones pueden ser desarrollados y mantenidos por muy bajos costos y sin la necesidad de una gran infraestructura.
Una forma sencilla de entender qué es la epigenética es pensar cómo se forman y diferencian las células de nuestro cuerpo. La vida humana empieza con la unión del óvulo y el espermatozoide, formando una única célula con un genoma compuesto por el ADN del padre y la madre. A las pocas horas, esta única célula empieza a dividirse repetidamente. A pesar de que todas las células de nuestro cuerpo tienen la misma información genética, éstas se desarrollan de manera distinta para finalmente formar los aproximadamente 250 tipos celulares diferentes que componen nuestro cuerpo, que cumplen funciones sumamente especializadas.
Mecanismos Epigenéticos: Cromatina y Expresión Génica
El ADN del núcleo de las células eucariotas no se encuentra ‘desnudo’, sino que se encuentra asociado a proteínas, las histonas entre otras, que lo compactan y forman lo que se conoce como cromatina (ADN + proteínas). En este sentido, según la cromatina esté más ‘abierta’ o más ‘cerrada’, se regula la accesibilidad de diversos factores al ADN, lo que afecta la expresión de genes. Existe una gran cantidad de proteínas encargadas de ‘escribir’, ‘borrar’ y ‘leer’ este código epigenético.
Es en las primeras etapas de la vida cuando se establecen muchas de las modificaciones epigenéticas necesarias para el normal desarrollo de los vertebrados, incluidos los humanos. En 2004, se publicó en Nature Neuroscience uno de los trabajos que produjo un quiebre en la forma de ver cómo el ambiente puede producir cambios epigenéticos que finalmente alteran la expresión de genes y el comportamiento. Este estudio demostró que las crías de madres que no ejercían cuidado parental, una vez llegadas a la adultez, mostraban poca tolerancia al estrés. Esta poca tolerancia se debía a alteraciones epigenéticas en neuronas implicadas en la respuesta al estrés.
Interesantemente, estas modificaciones epigenéticas podrían ser heredadas por la siguiente generación, o bien revertidas, ya sea por el tratamiento de fármacos o por el restablecimiento de las crías con madres que tenían cuidado parental. Esta fue la primera evidencia que demostró que el entorno psicosocial al que somos expuestos durante etapas muy tempranas del desarrollo tiene un profundo impacto en las respuestas fisiológicas y comportamentales del adulto.
Estos trabajos fueron también extrapolados a humanos, en donde de manera similar se demostró que madres que sufrieron experiencias traumáticas durante el embarazo o niños que sufrieron abusos o eventos traumáticos durante su infancia también tenían patrones anormales de metilación del ADN. Esta creciente vorágine de estudios han asociado a este establecimiento anómalo de marcas epigenéticas no sólo con la tolerancia al estrés, sino también con el autismo, la esquizofrenia y el cáncer, entre otros. Es por este motivo que grandes laboratorios multinacionales están desarrollando fármacos para modificar la cromatina, es decir, para manipular la información epigenética.
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Perspectiva Histórica de la Embriología
El estudio del desarrollo embrionario tiene una larga historia, marcada por debates entre diferentes teorías y el avance progresivo del conocimiento científico. El término epigénesis, acuñado por Conrad Weddington en 1942, ha evolucionado en su definición y aplicación.
Teorías y Descubrimientos Clave
Los orígenes de la embriología se remontan a la antigüedad. Aristóteles (384-322 a.C.) realizó importantes contribuciones, estudiando el desarrollo de los embriones de pollo a partir del huevo y sentando las bases de la embriología descriptiva y comparada. Sus trabajos, junto con los de otros pensadores griegos, fueron preservados y continuados a través de los siglos.
Durante la Edad Media, el pensamiento preformista, que postulaba la existencia de un homúnculo miniaturizado dentro del espermatozoide o el óvulo, predominó en Europa. Sin embargo, figuras como Leonardo da Vinci (1452-1519) y Andreas Vesalio (1514-1564) impulsaron la observación directa y la disección, sentando las bases para una comprensión más científica.
William Harvey (1578-1657), con su obra "Exercitationes de Generatione Animalium", defendió la epigénesis y realizó descripciones detalladas del desarrollo embrionario, incluyendo la formación de la placenta y las membranas fetales. Sus descubrimientos, basados en la observación de huevos de gallina, contradecían las teorías preformistas y marcaron una revolución en la embriología.
Posteriormente, Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) y su discípulo L. Hamm, fundadores de la histología, observaron los espermatozoides y los óvulos, aportando al debate sobre el origen de la vida. Marcello Malpighi (1628-1694), considerado el fundador de la embriología microscópica, describió las primeras etapas del desarrollo embrionario, aunque sus interpretaciones estuvieron influenciadas por las ideas preformistas ovistas.
El Nacimiento de la Embriología Experimental
A lo largo de los siglos XVIII y XIX, la epigénesis científica ganó terreno. Karl Ernst von Baer (1792-1876) es considerado uno de los iniciadores de la embriología analítica experimental. Sus trabajos sobre el desarrollo de los embriones de mamíferos, incluyendo el descubrimiento del óvulo mamífero, sentaron las bases de la semejanza embrionaria, reconocida posteriormente como ley embrional de Baer. También realizó estudios de organogénesis y describió el desarrollo de los blastocistos implantados en el útero de conejas.
La investigación en embriología continuó avanzando con el estudio de la segmentación, donde se observó que los blastómeros aislados son capaces de autodiferenciarse. Estos descubrimientos sentaron las bases para la comprensión de la morfogénesis y la diferenciación celular, con aplicaciones en medicina regenerativa y terapia celular.
La embriología contemporánea ha superado las concepciones preformistas, adoptando un enfoque epigenético para comprender los procesos morfogenéticos del desarrollo. La investigación actual se centra en desentrañar los mecanismos moleculares y celulares que regulan la formación de tejidos y órganos, con el objetivo de comprender y tratar diversas patologías.
El Dr. Eduardo A. Ferrer Casero, de la Universidad de Ciencias Médicas de Holguín, Cuba, ha contribuido significativamente a la enseñanza y la investigación en Embriología, destacando la importancia de este campo para la medicina.
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