El desarrollo comparativo de embriones producidos in vitro e in vivo es particularmente importante para el diseño de procedimientos de transferencia de embriones, especialmente cuando se requiere una sincronización precisa entre el embrión y la hembra receptora. Los embriones producidos in vitro a menudo alteran su desarrollo con repercusiones en su fisiología, lo que puede comprometer su viabilidad inmediata o introducir cambios observables durante su etapa postnatal. Estas alteraciones son resultado del proceso adaptativo que los embriones desencadenan para hacer frente al ambiente y la composición de los medios de cultivo.
Asincronía en el Desarrollo Embrionario In Vitro vs. In Vivo en Conejos
Un estudio se propuso determinar el grado de asincronía en el desarrollo embrionario entre embriones de conejo obtenidos in vivo y aquellos cultivados in vitro. Para ello, se utilizaron un total de 55 conejas multíparas no lactantes. Los embriones se clasificaron en el estadio de 16 células o mórulas tempranas a las 48 horas después del coito (hpc).
Métodos de Estudio y Clasificación
Los embriones se cultivaron durante 30 o 32 horas y su desarrollo se comparó con embriones de 72 hpc obtenidos directamente in vivo. Tanto los embriones in vitro como los in vivo a 72 hpc se clasificaron como mórulas tempranas o compactas. Para el análisis de los resultados, se empleó estadística bayesiana para estimar la diferencia entre ambos grupos de embriones y la probabilidad de que esta diferencia fuera superior a cero (P).
Resultados de la Asincronía
Los hallazgos revelaron que el porcentaje de mórulas compactas fue significativamente mayor en los embriones in vivo que en los embriones in vitro cuando se consideró una asincronía de +6 horas (73,5% frente a 32,8%, P=1,00). Sin embargo, el porcentaje de mórulas compactas fue similar cuando la asincronía se extendió a +8 horas.
Sistemas Innovadores para el Cultivo de Embriones de Conejo: Hidrogeles y Medios Condicionados
Con el objetivo de paliar los efectos adversos del cultivo embrionario, la investigación se ha centrado en evaluar nuevos sistemas de cultivo para embriones de conejo en estadio de 2 células. Una línea de estudio prometedora es el uso de hidrogeles derivados de la matriz extracelular (MEC) de tejidos y órganos reproductivos, los cuales emergen como sistemas prometedores para definir mejores condiciones de cultivo.
Evaluación de Hidrogeles de Colágeno y Matriz Oviductal
Se evaluó un hidrogel comercial de colágeno tipo I (Col I) y hidrogeles obtenidos del tejido oviductal de coneja. Los hidrogeles derivados de los oviductos se prepararon mediante un protocolo de descelularización utilizando soluciones de detergentes (sulfato de dodecilo sódico -SDS- y Tritón X-100) y DNasa 1.
El estudio se estructuró en dos bloques experimentales:
- El primer experimento investigó el efecto del medio de cultivo (DMEM/F12 50/50) suplementado con lactato y piruvato, y del tipo de hidrogel (Col I y un hidrogel de matriz oviductal de conejas inducidas a ovular 24h, Mov 24h) sobre el desarrollo embrionario in vitro e in vivo. Las conejas donantes fueron superovuladas con Coriofolitropina alfa y los embriones recuperados 24h después de ser inseminadas. Fueron asignados a diferentes grupos experimentales y cultivados durante 72h a 38ºC, 5% CO2 y humedad saturada. La viabilidad in vivo y el crecimiento postnatal de los embriones cultivados se estimaron mediante la transferencia de 452 embriones a 30 conejas receptoras.
- El segundo experimento evaluó el efecto de la suplementación del medio de cultivo (DMEM/F12 50/50 suplementado con lactato y piruvato) con un 10% de matriz oviductal de conejas inducidas a ovular 48 o 72 horas sobre el desarrollo embrionario in vitro y sobre la expresión génica de OCT4 o SOX2.
Resultados del Cultivo en Hidrogeles y Medios Condicionados
Los resultados de estos experimentos indicaron que el cultivo in vitro de embriones de conejo de 2 células en el medio de cultivo suplementado con EGF e ITS, o cultivados sobre hidrogeles, retrasó el desarrollo embrionario. Además, la viabilidad embrionaria in vivo fue baja, situándose entre el 9% y el 13%, lo cual es una consecuencia directa del cultivo embrionario durante 72 horas. A pesar de esto, el peso al destete de los conejos nacidos del medio suplementado con EGF e ITS y del cultivo sobre Gel Col I fue superior al de aquellos nacidos por inseminación artificial.
El efecto negativo de los prehidrogeles en el desarrollo in vitro se confirmó en el segundo experimento, donde la suplementación del medio de cultivo con un 10% de prehidrogeles a 48 y 72 horas sugirió la presencia de sustancias embriotóxicas en su composición. El análisis proteómico detectó 209 proteínas, mostrando que tres de ellas presentaban una abundancia diferente entre los prehidrogeles de 24 y 48 horas, y otras tres entre los de 24 y 72 horas. Curiosamente, los prehidrogeles de 48 y 72 horas mostraron un proteoma idéntico.
En general, el cultivo embrionario en medios condicionados y los distintos hidrogeles con el cultivo de células epiteliales de oviducto de conejo (ROECs) combinados con los medios de cultivo indujeron un retraso en el desarrollo embrionario temprano y una baja expresión de los genes analizados. También se observó una reducción de la tasa de supervivencia fetal, principalmente en los grupos donde se utilizó un medio específico para el cultivo epitelial suplementado con EGF e ITS. Sin embargo, los análisis del desarrollo postnatal mostraron pesos superiores para los grupos en los que se utilizó este medio, mientras que en el resto de los grupos los pesos fueron comparables a los controles, sin observar ninguna alteración significativa en el desarrollo postnatal.
Cultivo In Vitro de Células Germinales Primordiales (CGP) de Conejo
Las células germinales primordiales (CGP), obtenidas directamente del embrión, no son capaces de generar líneas celulares pluripotentes, pero adquieren esta capacidad si se mantienen en cultivos in vitro.
Caracterización In Vivo y Obtención Óptima de CGP
Un estudio se centró en: 1) caracterizar inmunohistoquímicamente las CGP de conejo en sus distintas etapas embrionarias in vivo; 2) reconocer el lugar óptimo para obtener estas células según la edad embrionaria; y 3) evaluar si las células nutricias murinas permiten la proliferación y supervivencia de las CGP en cultivo in vitro. Se obtuvieron embriones de 16 conejas de raza Neozelandesa blanca, de 7, 9, 10, 14 y 16 días post coito (dpc).
Un grupo de cada camada fue procesado "in toto" y en cortes por congelación para la tinción con fosfatasa alcalina y dos anticuerpos monoclonales: TEC-1 (que reconoce el antígeno SSEA-1 de superficie de las CGP) y PG-2 (que marca el citoplasma perimitocondrial de las CGP). Otro grupo de embriones fue cultivado durante 22 días usando células nutricias STO y MI-220.
En embriones de 7 días, el epiblasto del disco embrionario presenta células TEC-1 positivas y PG-2 negativas. Esta marca se mantiene durante la estadía transitoria en el alantoides y durante la migración a través del meso intestinal. Sin embargo, cuando las CGP colonizan la gónada, se transforman en TEC-1 negativas y PG-2 positivas.
Proliferación y Supervivencia In Vitro de CGP
La capacidad de proliferación in vitro de las células germinales primordiales de conejo resultó ser mucho menor que la observada en ratón, lo que guarda relación con la reducida capacidad de proliferación de estas células in vivo. La eficiencia proliferativa de las CGP in vitro se correlaciona con la edad del embrión del cual derivan. Asimismo, la morfología de las células in vitro también mantiene una estrecha relación con la edad del embrión de la cual son aisladas. La edad óptima en la que se obtuvieron la mejor proliferación y supervivencia en sucesivos pasajes fue a los 14 días post coito (grupo III), un período en el que las CGP están proliferando y migrando a través del meso intestinal.