La infertilidad masculina se ha incrementado notablemente a nivel mundial en los últimos años y es considerada como uno de los factores que más contribuyen a la infertilidad de la pareja, afectando a uno de cada 20 hombres. Además de los factores convencionales que la originan, como varicoceles o infecciones, el estrés oxidativo (EO) ha sido identificado como una causa de extraordinaria repercusión, presente en un 30-80 % de estos casos. El EO puede originar daños o deformidades a los espermatozoides y eventualmente infertilidad masculina. Por ello, la regulación redox en los espermatozoides y en el líquido seminal es un campo que requiere especial atención de los especialistas en reproducción humana.
El Estrés Oxidativo: Conceptos Fundamentales
Definición y Balance Redox
El estrés oxidativo es una situación que se produce cuando hay un desequilibrio entre la generación de especies de oxígeno reactivas (ROS, por sus siglas en inglés) y el sistema antioxidante del organismo. Refleja un balance relativo entre las ROS generadas y las ROS eliminadas dentro de los tejidos. Por eso, una alteración entre la generación de ROS y los mecanismos antioxidantes puede resultar en daño celular. Todas las células vivas están en condiciones normales expuestas a un nivel de estrés oxidativo. Las ROS son agentes oxidantes altamente reactivos y forman parte de una clase de moléculas conocidas como radicales libres (RL).
Un radical libre es cualquier molécula que contiene uno o más electrones desapareados, generados fisiológicamente por una transferencia de un electrón durante el metabolismo celular, por ejemplo, en los procesos que generan energía en la mitocondria, o en el proceso oxidativo de los leucocitos polimorfonucleares durante el mecanismo de defensa fisiológica. Los ROS se producen continuamente en el organismo. Bajo ciertas condiciones, el oxígeno inerte puede reaccionar inicialmente con moléculas orgánicas a través de procesos bioquímicos, dando lugar a la formación de ROS altamente reactivos. Estos se producen durante el metabolismo celular normal y, en algunas ocasiones, como respuesta a la exposición a radiaciones ionizantes, rayos ultravioleta, contaminación ambiental, humo del cigarrillo, hipoxia, exceso de ejercicio, reacción inflamatoria e isquemia.
Los RL tienen una vida media en el rango de nanosegundos a milisegundos y, por lo tanto, reaccionan con moléculas en su entorno más directo. Estos radicales incluyen: el anión superóxido (O2-), el radical hidroxilo (OH-) y el óxido nítrico. Existen otras moléculas como el peróxido de hidrógeno (H2O2) que no son radicales libres pero actúan fisiológicamente como tal; tienen una vida media más larga, pasan a través de la membrana y no están cargadas eléctricamente.
El Sistema Antioxidante
El sistema antioxidante se encarga de proteger los tejidos de los efectos perjudiciales de los radicales libres, ya sea reduciendo su formación, evitando la oxidación o reparando los daños producidos. Se conocen tres grupos de antioxidantes:
- Antioxidantes Primarios: Previenen la formación de nuevos radicales libres, transformándolos en moléculas menos perjudiciales antes de que puedan reaccionar, o evitando su formación a partir de otras moléculas. Entre ellos se encuentran:
- La enzima superóxido dismutasa (SOD), que convierte el O2- en peróxido de hidrógeno.
- La enzima glutatión peroxidasa (GPx), que convierte el peróxido de hidrógeno y los peróxidos lipídicos en moléculas inofensivas antes de que formen radicales libres.
- Las proteínas de unión a metales (ej: la ferritina y ceruloplasmina), que limitan la disponibilidad de Fe2+, necesaria para formar el radical OH.
- Antioxidantes Secundarios: Capturan los radicales libres, evitando las reacciones en cadena. Incluyen: la vitamina E (alfa-tocoferol), vitamina C (ascorbato), betacaroteno, ácido úrico, bilirrubina y albúmina.
- Antioxidantes Terciarios: Reparan las biomoléculas dañadas por los radicales libres. Entre ellos tenemos las enzimas reparadoras de ADN y la metionina sulfóxido reductasa.
Cualquier deficiencia en el sistema antioxidante provoca una pérdida de protección de los tejidos frente al ataque de los radicales libres.
Regulación Redox Fisiológica en el Espermatozoide
En el caso del espermatozoide humano, niveles adecuados de ROS son importantes para su funcionamiento normal. El espermatozoide sufre procesos controlados de óxido-reducción durante la hiperactivación, la capacitación y la reacción acrosómica. Bajo circunstancias fisiológicas, la actividad redox de los espermatozoides es mediada por el AMPc y la fosforilación de la tirosina, eventos bioquímicos que están asociados con la capacitación espermática. Pequeñas cantidades de ROS son necesarias para que el espermatozoide adquiera capacidad fertilizante. Un nivel fisiológico de ROS podría inducir la capacitación espermática y los eventos relacionados con ella.
El espermatozoide fue una de las primeras células en la cual se demostró la generación de especies reactivas de oxígeno. Esta actividad ha sido hasta ahora confirmada en espermatozoides de todas las especies de mamíferos estudiadas, incluyendo la rata, el ratón, el conejo, el caballo, el toro y en los espermatozoides humanos.
Estrés Oxidativo y Disfunción Espermática
Además de este papel biológico, el espermatozoide humano también parece sufrir estrés oxidativo, con impacto sobre la normalidad de sus funciones y sobre la integridad de su ADN nuclear y mitocondrial. Hay claras evidencias de que un factor significativo en la etiología de la infertilidad masculina es la pérdida de la capacidad fecundante como consecuencia del EO.
Vulnerabilidad del Espermatozoide al Daño Oxidativo
Los espermatozoides son células especialmente vulnerables al efecto de las ROS, principalmente por dos motivos. Primero, son células altamente especializadas que han reducido su citoplasma durante su proceso de formación, por lo que su contenido en antioxidantes es limitado. De esta manera, ellos dependerán para defenderse de la protección ejercida por el propio plasma seminal. Segundo, poseen en su membrana plasmática un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), necesaria para mantener la fluidez requerida en la fusión de membrana durante la fertilización. Estos PUFA son muy susceptibles al daño peroxidativo de los ROS.
Peroxidación Lipídica (PL)
La peroxidación lipídica (PL) del espermatozoide humano es considerada uno de los mecanismos claves del daño espermático, con la consecuente infertilidad. La PL es un indicador de estrés oxidativo y se inicia cuando se forma un radical hidroperoxilo, por captura de un hidrógeno del grupo metileno bis alílico de la molécula de los ácidos grasos. Los radicales libres, en presencia de oxígeno, producen a su vez radicales peroxilos (ROO), que se estabilizan por conversión al correspondiente hidroperóxido (ROOH) o bien por autooxidación o por la obtención de un átomo de hidrógeno de un lípido adyacente.
Estos hidroperóxidos, en presencia de metales de transición, se descomponen en productos sumamente tóxicos como los aldehídos, en especial el malondialdehído (MDA). Esta sustancia ha sido la base para la reacción con el ácido tiobarbitúrico, usada como ensayo de LPO en espermatozoides humanos. La PL es un proceso fisiopatológico que tiene como resultado una cascada de profundos cambios degradativos que afectan la organización y función de la membrana del espermatozoide humano.
La orientación de los ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática permite la fluidez óptima para que el espermatozoide cumpla con sus funciones específicas. La peroxidación lipídica puede comprometer la fluidez de la membrana y, como consecuencia, la función de numerosas bombas y canales que regulan el intercambio iónico y la concentración de nutrientes, como las ATPasa. En general se acepta que el efecto más significativo de la LPO sobre la membrana es la perturbación de su estructura y de su función. La pérdida de fluidez en la membrana afecta a la movilidad de los espermatozoides, así como a su capacidad para unirse (fusionarse) al ovocito y que se produzca la fecundación. El daño peroxidativo de la membrana conduce a inmovilidad y muerte celular.
Daño al ADN Espermático
Además de la pérdida de la funcionalidad de membrana, el daño peroxidativo iniciado por las ROS se asocia también con daño del ADN de la cabeza espermática. El estrés oxidativo puede llevar a la afectación y fragmentación del ADN espermático, tanto nuclear como mitocondrial, y a apoptosis (muerte celular). La integridad del ADN del espermatozoide es esencial en el proceso reproductivo, ya que tras la fecundación del óvulo, el ADN del espermatozoide será la mitad del contenido genético del embrión. Por ello, si el ADN del espermatozoide se encuentra fragmentado, puede dar lugar a problemas para conseguir la gestación o para su correcta evolución.
Se realizaron estudios en los cuales los espermatozoides fueron expuestos a una producción artificial de ROS, observándose un aumento significativo del daño al ADN en forma de modificaciones de las bases, deleciones y reordenamiento cromosómico. El EO se correlaciona también con la ruptura simple o doble de las hélices del ADN. Dos factores protegen el ADN espermático del ataque oxidativo: el característico empaquetamiento del ADN nuclear y la presencia de antioxidantes del plasma seminal.
Efectos sobre la Función Espermática
Niveles altos de ROS pueden aumentar la permeabilidad de la membrana plasmática del espermatozoide, causando diversas anormalidades en la morfología espermática, alterando así la fertilidad masculina. Elevados niveles de anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilos y óxido nítrico ponen en peligro la movilidad espermática, la viabilidad y la función de los gametos al interactuar con los lípidos de membrana, las proteínas y el ADN nuclear y mitocondrial. Hombres con altos niveles de ROS tienen menos probabilidad de tener hijos cuando se compararon con hombres que tienen bajos niveles de ROS.
Dada la importancia del efecto oxidativo sobre las células germinales que da origen a la infertilidad en el varón y a una alta tasa de abortos, este campo de la bioquímica espermática requiere especial atención. En circunstancias normales, los espermatozoides con daño del ADN no pueden participar en los procesos de fertilización por el daño peroxidativo colateral que se produjo en la membrana plasmática.
Fuentes de Especies Reactivas de Oxígeno en el Semen
Los RL que afectan al espermatozoide provienen principalmente de dos fuentes: de los espermatozoides defectuosos y de los leucocitos seminales. En teoría, la falta de protección del sistema antioxidante contribuiría a hacer que las células sean más vulnerables a niveles normales de RL, y/o la exposición a una producción excesiva de RL podría ser la responsable del estrés oxidativo en la línea germinal masculina.
Espermatozoides Defectuosos
Los espermatozoides defectuosos, particularmente aquellos con excesivo residuo citoplasmático (inmaduros, inmóviles y/o morfológicamente anormales), producen altas cantidades de ROS. Se ha propuesto la participación de una NADPH oxidasa, generadora de anión superóxido, similar a la encontrada en los leucocitos.
Leucocitos Seminales (Leucocitospermia)
Los leucocitos infiltrados en el semen, comúnmente encontrados en pacientes con infecciones de las glándulas sexuales accesorias, son una fuente significativa de ROS. Se ha demostrado que la activación de los leucocitos, fundamentalmente de los neutrófilos, es un paso importante para que ellos produzcan citoquinas y ROS. El H2O2, el anión superóxido y los nitratos y nitritos son producidos por macrófagos y granulocitos activados y son altamente tóxicos para el espermatozoide. En el plasma seminal, los granulocitos pueden liberar grandes cantidades de ROS como respuesta a una infección y/o inflamación. Los leucocitos producen hasta 1000 veces más ROS que los espermatozoides defectuosos.
El grado de daño espermático inducido por los ROS depende de la localización de la reacción inflamatoria, de la duración de la exposición del espermatozoide a estos productos y de la capacidad de la célula espermática para activar su sistema intrínseco de defensa inmunológica. Un número elevado de leucocitos en el plasma seminal (leucocitospermia) sugiere la presencia de una reacción inflamatoria en el tracto genitourinario masculino. En 1992, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció que más de 1x106 leucocitos/ml de semen debe considerarse anormal.
La presencia de leucocitos en el semen y sus efectos sobre el espermatozoide continúa siendo motivo de discusión. La mayoría de los estudios comparan el número de leucocitos presentes en el semen de pacientes infértiles con controles fértiles y los resultados obtenidos han sido contradictorios. Numerosos estudios han reportado que el aumento de leucocitos en el plasma seminal afecta negativamente los parámetros seminales, lo que sugiere que la leucocitospermia puede reflejar, al menos en algunos casos, actividad en el tracto genitouretral asociada a una anormal espermatogénesis o pobre viabilidad espermática.
Factores Ambientales y Estilo de Vida
Factores ambientales tales como el humo del cigarrillo, alcohol, obesidad, diabetes, contaminantes ambientales y pesticidas, radiaciones electromagnéticas, estrés, altas temperaturas, infecciones y el varicocele, inducen estrés oxidativo sistémico, permitiendo una disminución de vitaminas antioxidantes del plasma seminal y la inducción de daño del ADN en el espermatozoide. Los fumadores, además, presentan una disminución en el contenido de antioxidantes como vitamina C y E en el plasma seminal, lo cual hace más vulnerable el esperma a la oxidación.
Otros fármacos como la aspirina y el paracetamol pueden generar también EO al incrementar la actividad de los citocromos P450 y, por tanto, pueden amplificar la generación de ROS. La exposición profesional a determinadas sustancias como el plomo, cadmio, mercurio, manganeso, óxido de etileno, cloruro de vinilo, así como la radiactividad y los rayos X, se han asociado también a factores desencadenantes de trastornos de fertilidad masculina.
Diagnóstico del Estrés Oxidativo Espermático
Es de aceptación corriente que una sola prueba no puede establecer la capacidad fertilizante del varón. Además, toda valoración debe tener un umbral que provea capacidad predictiva para discriminar entre un hombre fértil de uno infértil. Mucho se ha trabajado en el desarrollo de pruebas adecuadas para estudiar las ROS y el EO que puedan ayudar en el conocimiento de la infertilidad masculina.
Dado que el EO expresa un desequilibrio entre los niveles de producción de ROS y la protección antioxidante del semen, es concebible que el estudio del EO pueda conocerse a través de la valoración de las ROS y de la capacidad antioxidante total de la muestra de semen (TAC - Total Antioxidant Capacity). En una suspensión de espermatozoides, los diferentes niveles de ROS pueden medirse utilizando quimioluminiscencia. A su vez, la TAC en el plasma seminal puede también medirse a través de un ensayo quimioluminiscente. Es por ello que se propuso un índice ROS-TAC para poder diagnosticar el estrés que afecta a los gametos masculinos.
El nitroblue tetrazolium (NBT) es un colorante muy soluble en agua que es reducido por los radicales libres de oxígeno al aceptar electrones. El resultado de esta reducción es un cambio de color que vira al azul oscuro por la formación de formazán. Esta técnica refleja indirectamente la actividad generadora de ROS en el citoplasma celular y puede ayudar a determinar el origen de dichas sustancias en una suspensión variada de células, como las que presenta el semen.
Para la cuantificación de LPO, se utiliza el método del ácido tiobarbitúrico que emplea cantidades catalíticas de Fe++ y ascorbato, con la formación de MDA. Sobre la base del conocimiento de los mecanismos de producción del EO, se desarrolló el Estrés Test Modificado (MOST), con el objeto de predecir la fertilización de ovocitos in vitro en el contexto de técnicas de reproducción asistida. Valores bajos de MOST indican un aumento de la peroxidación lipídica que puede interferir con la capacidad fértil del espermatozoide. El valor de corte de la prueba fue de 0.39, correspondiente a la más alta sensibilidad y especificidad.
Uno de los mayores problemas que se producen al determinar ROS en diferentes poblaciones de espermatozoides humanos es su invariable contaminación con leucocitos. Es importante para la clínica andrológica conocer la producción de ROS de una muestra determinada y saber si esta es genuinamente espermática o involucra el infiltrado leucocitario.
Estrategias Terapéuticas y Prevención
Recientes estudios han contribuido a clarificar la base molecular de la intensa actividad de óxido-reducción observada por el espermatozoide humano defectuoso, la naturaleza de las estructuras subcelulares responsables de esta actividad y los posibles mecanismos por los cuales el estrés oxidativo afecta a estas células. Dada la importancia del efecto oxidativo sobre las células germinales que da origen a la infertilidad en el varón y a una alta tasa de abortos, este campo de la bioquímica espermática requiere especial atención de los especialistas en reproducción humana, a fin de mejorar los métodos para el diagnóstico y prevención de las diferentes patologías asociadas a la infertilidad masculina.
Suplementación con Antioxidantes
Para proteger a los espermatozoides de los daños producidos por el exceso de ROS y el estrés oxidativo, se ha propuesto la terapia con antioxidantes. Estos pueden ser ingeridos mediante la dieta o a través de suplementos. Entre los antioxidantes más empleados se encuentran las vitaminas C y E, el selenio, el zinc, la coenzima Q10 y la L-carnitina.
Sin embargo, un exceso de antioxidantes podría llevar a estrés reductivo y a una disminución de los niveles fisiológicos de ROS, necesarios para que el espermatozoide desarrolle sus funciones correctamente. Del mismo modo, si el varón no presenta estrés oxidativo, la terapia con antioxidantes no estaría indicada, ya que podría llevar también a estrés reductivo. Los hombres infértiles tienen niveles más bajos de antioxidantes que los hombres fértiles, lo cual ha sido atribuido a la ineficiencia del sistema antioxidante.
Cambios en el Estilo de Vida
Realizar ejercicio de manera moderada contribuye a un mejor balance oxidativo en el semen y a un aumento en los niveles de testosterona, mejorando así la calidad seminal. Además, el varón puede realizar otros cambios en su estilo de vida como, por ejemplo, dejar de fumar o reducir el consumo de alcohol, evitar la obesidad, y protegerse de contaminantes ambientales.
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Consideraciones Clínicas
Estudios han demostrado que existen diferencias significativas entre los marcadores evaluados en el líquido seminal con respecto al espermatozoide, lo cual sugiere la existencia de un estado redox diferenciado entre ambos compartimentos. Estos hallazgos demuestran la necesidad de evaluar el nivel de estrés oxidativo tanto en las células sexuales como en el fluido que las contiene. Ello contribuirá, sin lugar a dudas, a un diagnóstico más eficaz e integral de la capacidad fértil del hombre.
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