La Producción In Vitro de Embriones y su Relevancia
La producción in vitro (PIV) de embriones goza de múltiples aplicaciones, entre las que cabe destacar la obtención de animales transgénicos o genéticamente modificados. Estos animales resultan de amplia utilidad en el ámbito biomédico y podrían llegar a serlo en el sector agropecuario, consolidándose como una herramienta esencial en la investigación biomédica y contribuyendo de forma decisiva al conocimiento de enfermedades y procesos celulares básicos.
En este sentido, tanto la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) con espermatozoides transfectados, como la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) con células transfectadas, han demostrado ser estrategias válidas para generar animales con ADN exógeno integrado de manera estable, capaces de transmitirlo a su descendencia. Sin embargo, para lograrlo, es necesario disponer de un gran número de embriones PIV.
A pesar del desarrollo durante las últimas décadas de sistemas de PIV de embriones de porcino para estas estrategias, y la disponibilidad de una gran variedad de protocolos, persisten aún ciertos puntos críticos que limitan el desarrollo embrionario y, por lo tanto, su aplicación a gran escala.
Optimización de Protocolos de Micromanipulación en Porcino
El objetivo principal de un reciente estudio ha perseguido la optimización de los protocolos de ICSI y SCNT con el fin de mejorar la viabilidad de los embriones PIV de porcino. La microinyección es un método para inyectar mecánicamente células, material genético, péptidos, fármacos u otros agentes exógenos directamente en células o tejidos utilizando una pipeta muy pequeña. Por el contrario, el material también puede ser extraído de la muestra, como en la enucleación de células.
Estudio de la Maduración In Vitro (MIV) y Activación Oocitaria para SCNT
El planteamiento inicial consistió en abordar el estudio tanto de la maduración in vitro (MIV) como de la activación oocitaria en el marco de la SCNT. Para ello, se seleccionó de entre tres propuestas de activación artificial el protocolo de activación eléctrica, el cual resultó ser el más eficiente bajo las condiciones de trabajo estudiadas. Posteriormente, se analizó el efecto del suplemento de suero en el medio de MIV, constatando que no se incrementaba el desarrollo de embriones partenogenotas producidos mediante activación eléctrica ni de aquellos producidos mediante SCNT.
Optimización de la Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI)
Con el fin de optimizar la técnica de ICSI, se abordaron diferentes aspectos como la concentración de Ca2+ en el medio de microinyección, el pre-tratamiento espermático con Triton X-100 (TX), así como la adición de suplementos de cafeína o cisteína al medio de cultivo in vitro (CIV) pos-ICSI. El objetivo era favorecer la descondensación del núcleo espermático y la activación oocitaria.
Resultados Obtenidos en la Optimización de ICSI:
- La concentración de Ca2+ no influyó en la tasa de división ni en la de desarrollo de embriones partenogenotas procedentes de oocitos microinyectados sin espermatozoide (sham injection).
- La cafeína no incrementó la formación pronuclear ni el desarrollo embrionario posterior; además, en combinación con el pre-tratamiento espermático con TX, redujo la activación oocitaria y el desarrollo embrionario.
- La formación pronuclear no se vio incrementada por el pre-tratamiento espermático con TX ni por el tratamiento con cisteína, independientemente del momento de la evaluación estudiado.
Fecundación in vitro e ICSI, ¿en qué consisten y que se hace a continuación de ellas?
La Micromanipulación en la Edición Genómica y Creación de Modelos Animales
En la actualidad, la microinyección pronuclear o citoplasmática sigue siendo uno de los métodos más utilizados para la edición genómica y la producción de modelos animales. La microinyección de componentes CRISPR en cigotos y embriones requiere una combinación de precisión extrema, estabilidad mecánica y fluidez de trabajo.
Requerimientos Clave de los Sistemas de Micromanipulación
En este contexto, el sistema de micromanipulación y el microscopio invertido no son simplemente accesorios, sino elementos críticos que determinan la precisión de la inyección, la integridad de la muestra y la reproducibilidad de los resultados.
Parámetros Cruciales para el Éxito de la Microinyección
En la rutina de un laboratorio que trabaja con CRISPR en modelos animales, varios factores técnicos condicionan el éxito de la microinyección:
Control de movimiento de alta precisión
Trabajar en el entorno de cigotos y pronúcleos implica desplazamientos muy finos en los tres ejes. El sistema debe permitir una aproximación progresiva y controlada del capilar, con respuesta inmediata del mando de control y sin "saltos" intermedios. Esto reduce maniobras correctivas y ayuda a mantener una entrada más limpia y reproducible en cada inyección. La microinyección es una tarea de precisión donde diferencias de posición a nivel submicrométrico pueden marcar la diferencia entre el éxito y el fracaso.
Estabilidad mecánica y reducción de vibraciones
Cualquier vibración o juego mecánico se traduce en desplazamientos indeseados del capilar sobre la muestra. Un sistema con alta estabilidad mecánica y trabajo prácticamente libre de vibraciones facilita mantener la posición del capilar durante el contacto con el cigoto o el pronúcleo, algo especialmente relevante cuando se trabaja con embriones tempranos sensibles y con volúmenes de trabajo elevados.
Gestión del posicionamiento y ergonomía del operador
Más allá de la precisión puntual, la rutina de trabajo exige funciones de retorno a posición (Home), memoria de posiciones y límites de recorrido, especialmente en el eje Z, para evitar roturas de capilar o contactos excesivos con la muestra. Combinado con un diseño ergonómico del mando, esto permite trabajar durante más tiempo, con menos fatiga, manteniendo la misma calidad de movimiento a lo largo de toda la sesión.
Integración con sistemas de microinyección
El micromanipulador no trabaja de forma aislada: necesita coordinarse con microinyectores electrónicos y, en algunos casos, sistemas piezoeléctricos. La posibilidad de conectarlo de forma directa con microinyectores como FemtoJet® 4i/4x o con sistemas como PiezoXpert® simplifica la configuración, reduce el cableado innecesario y ayuda a estandarizar protocolos entre usuarios.
Adaptación a aplicaciones exigentes de edición genética
No es lo mismo una simple inyección de marcador que una inyección pronuclear o citoplasmática en proyectos de edición CRISPR/Cas o TALEN. Un sistema pensado para estas aplicaciones debe permitir trabajar con ovocitos y embriones tempranos, manejar diferentes tipos de muestras (células en suspensión, micropartículas, etc.), y ofrecer perfiles de uso adaptables al tipo de técnica (transferencia celular, inyección de DNA/RNPs, etc.). El micromanipulador TransferMan® 4r es un ejemplo de equipo diseñado para aplicaciones de microinyección en CRISPR.
Equipamiento para Micromanipulación Embrionaria
Los modelos biológicos, ya sean células individuales, tejidos u organismos completos, son sensibles a los cambios en las condiciones ambientales. Por ello, la elección del equipo es fundamental:
- Los microscopios invertidos de la serie ECLIPSE Ti2 son adecuados para diversas aplicaciones de microinyección. Las opciones de micromanipulador/microinyector de diferentes fabricantes son compatibles con el Ti2. Se puede aplicar una magnificación intermedia dentro del cuerpo del microscopio Ti2 (1.5X y 2.0X disponibles) para obtener imágenes detalladas utilizando objetivos de baja magnificación. Además, están disponibles varias opciones de condensador de larga distancia de trabajo que no interfieren con el equipo de micromanipulación.
- Los microscopios invertidos ECLIPSE Ts2R y Ts2R-FL también pueden equiparse para microinyección, pero cuentan con un cuerpo más compacto que se adapta bien a gabinetes de bioseguridad y otros espacios reducidos. El modelo Ts2R-FL proporciona además epifluorescencia de campo amplio utilizando fuentes de luz LED integradas.
- Los microscopios estéreo SMZ25 y SMZ18 también pueden equiparse para trabajos de microinyección.
Otros factores importantes en el entorno de trabajo son la fuente de iluminación (diodos emisores de luz (LEDs) o lámparas halógenas) y la disponibilidad de control térmico, ya que la regulación de la temperatura es crucial para la salud celular.
Técnicas Complementarias de Micromanipulación en Reproducción Asistida
Las técnicas de micromanipulación en reproducción asistida son complementarias a la Fecundación In Vitro, indicadas en casos especiales para mejorar los resultados:
- Eclosión Asistida: Consiste en realizar un pequeño orificio mediante un láser en la zona pelúcida (la capa que rodea el embrión).
- Biopsia Embrionaria: Se realiza para poder llevar a cabo un estudio genético del embrión (Test Genético Preimplantacional). Consiste en la extracción de una de sus células para ser analizada. Puede hacerse tanto en el tercer día de su desarrollo como entre el quinto y el sexto día, en estadio de blastocisto.
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