El almacenamiento eficiente de recursos genéticos, como los ovocitos inmaduros y los embriones, es crucial para la biotecnología reproductiva y la investigación. La criopreservación, particularmente la vitrificación, se ha establecido como una técnica prometedora para este propósito, aunque aún enfrenta desafíos relacionados con las tasas de supervivencia celular. La vitrificación, una técnica de congelación ultrarrápida, busca la solidificación de las células en un estado vítreo, similar al cristal, para evitar la formación de cristales de hielo, que son perjudiciales para la integridad celular. En este contexto, el uso de crioprotectores como el etilenglicol (EG) es fundamental para mitigar los daños y mejorar la viabilidad.
Efecto del etilenglicol en la morfología de ovocitos bovinos inmaduros
Introducción a la criopreservación de ovocitos bovinos
En la biotecnología animal, procedimientos como la aspiración folicular transvaginal, la maduración in vitro y la fertilización in vitro generan una gran cantidad de células germinales y embriones. Sin embargo, a menudo este valioso recurso genético se descarta debido a la falta de procedimientos de conservación adecuados o a la ineficiencia de los protocolos de criopreservación, que pueden provocar altas tasas de deterioro y muerte celular por la formación incontrolada de cristales de hielo. Esta situación ha impulsado el desarrollo de técnicas y el empleo de sustancias crioprotectoras para mitigar estas consecuencias.
La vitrificación y el papel del etilenglicol
La vitrificación es una técnica de congelación ultrarrápida que se basa en el contacto directo de las células, inmersas en una solución de vitrificación con agentes crioprotectores (entre 4-6 mol/L), con nitrógeno líquido. Este proceso induce una solidificación que forma un estado vítreo o similar a cristal, lo que disminuye significativamente la formación de cristales de hielo. La criopreservación por vitrificación, con el uso de crioprotectores como el etilenglicol (EG) y el dimetilsulfóxido (DMSO), ha mejorado la eficiencia en la preservación de células germinales y embriones de diversas especies. Esto se debe a que permite aumentar la velocidad de enfriamiento, así como disminuir los efectos osmóticos y tóxicos y las alteraciones a nivel celular. A pesar de estas ventajas, los índices de supervivencia de ovocitos vitrificados en vesícula germinal en bovinos siguen siendo muy bajos. Aunque el etilenglicol ha demostrado ser el crioprotector más conveniente para la vitrificación de estas células, se han utilizado diversas concentraciones y combinaciones con otros crioprotectores. Por ello, es crucial determinar las concentraciones de etilenglicol que menos afectan la integridad de los ovocitos.
¿Cómo es el paso a paso de la vitrificación de óvulos?
Evaluación de concentraciones de etilenglicol
Un estudio evaluó tres combinaciones de concentraciones de etilenglicol en un protocolo de vitrificación de dos pasos en pajilla abierta estirada (OPS) para ovocitos bovinos inmaduros: 1, (7.5% y 15%); 2, (10% y 20%) y 3, (20% y 40%). El objetivo fue determinar cuál de estas concentraciones prevenía en mayor proporción las alteraciones morfológicas post-desvitrificación.
Metodología del estudio
La recolección de ovarios bovinos se realizó en la planta de faenado de la Central Ganadera del municipio de Medellín, Colombia. Los procedimientos de aspiración folicular, selección de complejos ovocito-cúmulus (COCs), vitrificación y evaluación morfológica post-desvitrificación se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Los COCs se recolectaron de folículos de 2 a 6 mm, se seleccionaron por criterios de capas múltiples y compactas de células de la granulosa y ooplasma homogéneo, y se lavaron en medio TL-Hepes. Las pajillas abiertas estiradas (OPS) se elaboraron a partir de pajillas convencionales de 0.25 ml. Para la criopreservación, los COCs se pasaron por una primera solución de vitrificación (V1) por 45 segundos y por una segunda solución (V2) por 25 segundos, ambas basadas en TCM-199, 10% de suero fetal bovino (SFB) y las concentraciones de etilenglicol del tratamiento. Los COCs se empacaron en las OPS en un volumen de 2 μl de la segunda solución y se sumergieron en nitrógeno líquido.
Después de 30 días, las pajillas se desvitrificaron exponiéndolas al aire durante 5 segundos y sumergiéndolas en soluciones de sacarosa de concentraciones decrecientes y medio Holding. La evaluación morfológica post-desvitrificación de los COCs se realizó con un microscopio invertido de contraste de fase a 400X, considerando características morfológicas preestablecidas. Los resultados se analizaron mediante un diseño de bloques al azar, análisis de varianza (ANOVA) y prueba Student-Newman-Keuls Múltiple utilizando el programa estadístico SAS, versión 8.0.
Resultados y discusión
Los resultados mostraron que el protocolo que utiliza 20% y 40% de etilenglicol en dos soluciones de vitrificación produjo menores alteraciones en la morfología post-desvitrificación de los ovocitos bovinos inmaduros. El tratamiento 3 (20% y 40% EG) presentó un porcentaje estadísticamente mayor (p<0.05) de ovocitos desvitrificados en la categoría de cúmulus compacto (62.4%), en comparación con los tratamientos 1 (7.5% y 15% EG) y 2 (10% y 20% EG), que tuvieron porcentajes de 34.5% y 37.3% respectivamente. Además, el tratamiento 3 mostró el menor porcentaje de ovocitos fragmentados (27.6%) frente al 56.4% y 48.3% de los tratamientos 1 y 2.
Esto sugiere que, entre las concentraciones de EG evaluadas, las utilizadas en el tratamiento 3 (20% y 40%) tienen un mayor efecto preventivo sobre los daños estructurales derivados del proceso de criopreservación. Esto concuerda con reportes que indican que dichas concentraciones permiten obtener COCs con mejores tasas de maduración nuclear in vitro, lo que sugiere una relación entre la morfología del complejo y su competencia meiótica o maduración nuclear.
A pesar de la utilidad de la evaluación morfológica, los índices de supervivencia de ovocitos inmaduros vitrificados en bovinos aún son bajos. Esto podría deberse a daños en las membranas, las comunicaciones intracelulares entre el ovocito y las células del cúmulus, el citoesqueleto, o alteraciones en proteínas, enzimas y organelas intracelulares, además de la zona pelúcida.
Uso de etilenglicol en la transferencia de embriones bovinos
El etilenglicol (EG) es el crioprotector más comúnmente utilizado en la transferencia comercial de embriones bovinos. Su rápida permeabilidad permite la transferencia directa de embriones al útero de las receptoras después del descongelamiento, sin la necesidad de remover el crioprotector. La mayoría de los protocolos profesionales enfatizan la importancia de mantener la exposición de los embriones al EG por un máximo de 5 a 10 minutos antes del congelamiento. Sin embargo, existen pocos reportes que confirmen los efectos tóxicos del EG cuando los embriones son expuestos por períodos de tiempo mayores.
Un experimento fue diseñado para evaluar el efecto de diferentes períodos de exposición a 1.5 M de EG sobre la tasa de supervivencia de embriones bovinos producidos in vivo, antes del congelamiento. Todos los embriones utilizados fueron mórulas y blastocistos de grado 1 según la clasificación de la IETS. Los embriones se seleccionaron y distribuyeron aleatoriamente en diferentes grupos de tratamiento, siendo expuestos a 1.5M de EG y 0.25 M de sacarosa (Vigro EG Freeze with sucrose, Bioniche Animal Health, USA) y envasados en pajuelas plásticas de 0.25 mL a temperatura ambiente (22 a 25°C). Después de una semana de almacenamiento en nitrógeno líquido, los embriones se descongelaron en baño de maría a 30°C durante 12 segundos. El experimento se realizó en dos ensayos, con exposiciones de 5, 10 y 20 minutos (ensayo 1), o 10, 20 y 30 minutos (ensayo 2).
Efecto de la concentración de crioprotectores en la viabilidad de embriones murinos
La importancia de la criopreservación embrionaria
La criopreservación de embriones es un procedimiento fundamental en las técnicas de reproducción asistida, aplicable a especies domésticas de interés económico, especies silvestres y animales de laboratorio. Aunque la congelación lenta ha sido el método más frecuente, la vitrificación ha emergido como una alternativa rápida, donde los embriones se sumergen en soluciones altamente concentradas de crioprotectores y luego en nitrógeno líquido, congelándose en segundos. Este método permite la solidificación de la solución crioprotectora a un estado vítreo, evitando la formación de cristales de hielo.
La vitrificación es un proceso complejo que consta de cinco pasos: equilibración, enfriamiento, almacenamiento, calentamiento y dilución. La equilibración, que implica la exposición de los embriones a los crioprotectores, es clave para mejorar la viabilidad, ya que los embriones solo sobreviven cuando están suspendidos en una solución con uno o varios solutos crioprotectores. Altas concentraciones de un solo crioprotector pueden lograr una tasa de vitrificación aceptable, pero a menudo resultan tóxicas para los embriones. El desafío radica en encontrar solutos o mezclas de solutos que permitan una solución vitrificable no tóxica para las células.
Evaluación de soluciones de vitrificación con etilenglicol, glicerol y sucrosa
Para determinar la solución de vitrificación (SV) más eficaz, se evaluó la apariencia morfológica post-vitrificación de embriones murinos (Mus musculus) utilizando etilenglicol (EG), glicerol (G) y sucrosa (SUC). Se probaron ocho mezclas diferentes de crioprotectores:
- SV1: 0% de crioprotectores
- SV2: 50% EG
- SV3: 50% G
- SV4: 50% SUC
- SV5: 25% EG + 25% G
- SV6: 50% EG + 0.3M SUC
- SV7: 50% G + 0.3M SUC
- SV8: 25% EG + 25% G + 0.3M SUC
Metodología y resultados
Se utilizaron ratones hembra vírgenes de la cepa NIH (National Institute of Health) y machos de la misma cepa para la obtención de embriones. Se aplicó un protocolo de superovulación para recolectar y clasificar los embriones. Un total de 160 embriones murinos en estadio de blastocisto de excelente calidad fueron expuestos a las ocho soluciones de vitrificación. Grupos de 20 embriones se sometieron a la fase de equilibración en tres pasos (5 min, 5 min y 30 s). Los embriones se aspiraron en pajuelas mOPS (modified open pulled straw), almacenando cuatro embriones por pajuela, y se expusieron a vapores de nitrógeno líquido durante 5 minutos antes de sumergirlos y almacenarlos. La desvitrificación implicó extraer la pajuela del nitrógeno líquido y mantenerla a temperatura ambiente por 5 segundos. Durante la dilución, el contenido de las pajuelas se expuso a tres soluciones con concentraciones decrecientes de sucrosa (1; 0.5 y 0.25M) por 5 minutos cada una. Finalmente, los embriones se evaluaron bajo un microscopio invertido para determinar la tasa de supervivencia morfológica y la presencia de anormalidades.
Se recuperó el 90% (144/160) de los embriones criopreservados. Es crucial el uso de crioprotectores, ya que ningún embrión vitrificado sin ellos presentó viabilidad (0%; 0/17). En contraste, el 60.6% (77/127) de los embriones que utilizaron crioprotectores fueron viables. De las soluciones que contenían crioprotectores, la SV5 (25% EG + 25% G) y la SV8 (25% EG + 25% G + 0.3M SUC) mostraron los porcentajes más altos de embriones con apariencia morfológica normal post-vitrificación, con 94.7% y 88.9% respectivamente, sin diferencia significativa entre ambas. Estos resultados sugieren que la mezcla de crioprotectores contribuye a una mejor tolerancia al proceso de criopreservación, obteniéndose una mayor viabilidad y menor frecuencia de anormalidades morfológicas.
¿Cómo es el paso a paso de la vitrificación de óvulos?
Discusión sobre la eficacia del etilenglicol en embriones murinos
La SV5, compuesta por 25% de glicerol y 25% de etilenglicol, produjo el mayor número de embriones con apariencia morfológica normal (94.7%). La SV8 (25% de glicerol, 25% de etilenglicol más 0.3M de sucrosa) también mostró un alto porcentaje de viabilidad (88.9%). Estos resultados son consistentes con estudios previos que indican que el etilenglicol es un crioprotector altamente efectivo debido a su bajo peso molecular, alta permeabilidad y baja toxicidad. La combinación de crioprotectores, como en la SV5, donde el glicerol actúa como protector primario de la membrana citoplasmática y el etilenglicol protege las estructuras intracelulares, optimiza la criopreservación. Generalmente, las mezclas de crioprotectores permiten la vitrificación a concentraciones más bajas, lo que reduce la toxicidad y aumenta la viabilidad embrionaria. Otros estudios también han demostrado que la adición de diferentes crioprotectores permeables a la solución disminuye la toxicidad y mejora la viabilidad embrionaria.
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