Descubrimiento y Papel de los Espermatozoides Caninos: Métodos de Recolección, Criopreservación y Biotecnología Reproductiva

La reproducción canina, tanto natural como asistida, es un campo de constante investigación y desarrollo. Entre los diversos factores que afectan a la conservación del semen, se sabe que tanto el método de recolección como la contaminación con bacterias, glóbulos rojos o leucocitos juegan un papel principal en el resultado final.

Métodos de Recolección de Espermatozoides Caninos

Se han descrito diferentes técnicas para la recolección de espermatozoides eyaculados y epididimarios en perros. Sin embargo, cuando no es posible la recolección de un eyaculado completo, la cauda del epidídimo representa una fuente clave de espermatozoides maduros y, en la mayoría de los casos, la última oportunidad para la reproducción en animales en peligro de extinción o muertos.

Recolección de Espermatozoides del Epidídimo

Se han descrito varios métodos para recuperar los espermatozoides del epidídimo. Estos incluyen, entre otros, el método de lavado retrógrado (enjuague), la aspiración de espermatozoides del epidídimo con una sola incisión (SESA) y la picadura del epidídimo (EM).

Método de Lavado Retrógrado

El método de lavado retrógrado se realiza insertando una aguja de calibre 24 en los conductos deferentes y enjuagando el contenido del conducto con diluyente de semen o aire. Este método ha demostrado ser eficaz en varios estudios realizados en perros y produce una mayor recuperación de espermatozoides que SESA o EM. Sin embargo, el método de lavado, aunque eficaz, no se puede utilizar si el conducto deferente se acorta durante una orquiectomía o si el conducto deferente o el conducto epididimario se dañan durante la extracción de los vasos sanguíneos de la superficie del epidídimo.

Picadura del Epidídimo (EM)

La picadura del epidídimo se ha sugerido como una opción de respaldo cuando el método de lavado no es factible. Un problema importante cuando se emplea la picadura del epidídimo es la contaminación por eritrocitos, ya que la hemospermia afecta negativamente la estructura y función de los espermatozoides después de la descongelación. Rijsselaere et al. demostraron que una mezcla de sangre superior al 4% daba lugar a una caída de los parámetros espermatozoides posteriores a la descongelación, como la motilidad de los espermatozoides, la integridad de la membrana y el estado acrosómico, a diferencia del semen canino refrigerado, conservado a 4 °C, donde la adición de sangre hasta un 10% no tuvo un efecto perjudicial sobre las características funcionales de los espermatozoides.

La congelación y descongelación de muestras hematospérmicas caninas dio lugar a alrededor del 58% de hemólisis de eritrocitos, lo que a su vez condujo a la liberación de hemoglobina de los eritrocitos rotos. Además, estudios recientes han demostrado que la hemoglobina tiene efectos citotóxicos directos y desempeña un papel importante en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) dañinas, que pueden causar efectos negativos indirectos. El contenido sanguíneo también puede interferir con dispositivos analíticos como el análisis de espermatozoides asistido por computadora (CASA) durante la evaluación de la calidad del semen.

Por lo tanto, la eliminación de eritrocitos antes de la congelación podría ser un paso esencial para mejorar la calidad del semen post-descongelación después de la EM, especialmente en muestras altamente contaminadas. Sin embargo, la centrifugación simple hará que tanto los espermatozoides como los eritrocitos disminuyan en el gránulo, por lo que los científicos investigaron diferentes técnicas para eliminar eritrocitos. Entre estas, la centrifugación en gradiente separa eficientemente los espermatozoides móviles viables de los espermatozoides y eritrocitos inmóviles muertos, pero afecta negativamente el rendimiento de los espermatozoides móviles viables. La baja tasa de recuperación de espermatozoides representa una desventaja relevante cuando se trata de espermatozoides del epidídimo, que solo se pueden recolectar una vez.

Por lo tanto, se necesita un protocolo que garantice la ausencia o una pérdida limitada de espermatozoides durante la separación de espermatozoides y eritrocitos. Verheyen et al. fueron los primeros en describir el uso de un tampón de lisis eritrocitaria (BEL) en muestras hematospérmicas humanas y probaron su toxicidad en espermatozoides de donantes capacitados. Los resultados mostraron que después de una exposición de 5 minutos de los espermatozoides al ELB, la motilidad y vitalidad posteriores de los espermatozoides no se vieron afectadas en una prueba de supervivencia espermática de 48 h. Desde entonces, el medio ELB se utiliza de forma rutinaria en la reproducción humana para la preparación de muestras testiculares para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides y, hasta donde sabemos, el efecto del ELB aún no se ha probado en el semen de perro.

Aspiración de Espermatozoides del Epidídimo con una Sola Incisión (SESA)

La aspiración de espermatozoides del epidídimo (SESA) de una sola incisión se considera un método ideal para la recuperación de espermatozoides del epidídimo, ya que puede funcionar independientemente de limitaciones como la obstrucción del conducto deferente y la contaminación. Para esta técnica, el epidídimo se corta, en lugar de cortarse en trozos pequeños, con una sola incisión durante la cual se recogen el líquido epididimario y los espermatozoides que fluyen.

Estudios Comparativos de Métodos de Recolección

En un estudio, un total de quince perros sanos de entre uno y seis años fueron sometidos a orquiectomía rutinaria. Inmediatamente después, los testículos y epidídimos se colocaron en un medio de retención y se transportaron al laboratorio para su procesamiento. Antes de la recolección, los testículos se lavaron y secaron. Cada epidídimo, junto con los conductos deferentes, se diseccionó cuidadosamente del testículo, se pesó y los espermatozoides del epidídimo se extrajeron mediante EM o SESA.

• Para el método EM, los epidídimos de la cola junto con los conductos deferentes se colocaron en una placa de Petri con 7 mL de DPBS. Los espermatozoides presentes en el conducto deferente se exprimieron y la cola del epidídimo se sometió a picado con una hoja de bisturí.
• Para el método SESA, la cola epidídimo se fijó con una pinza hemostática. Se realizó una sola incisión en la cola epidídimo, evitando los vasos sanguíneos, y el líquido epididimario y los espermatozoides que fluían se recogieron con una pipeta automática.

La motilidad de los espermatozoides se evaluó subjetivamente bajo un microscopio de contraste de fase. La viabilidad y morfología de los espermatozoides se evaluaron en frotis teñidos con eosina/nigrosina bajo un microscopio óptico. Se encontró una correlación muy fuerte entre el peso del epidídimo y el TSO para la técnica EM (p = 0,002, coeficiente de correlación de Spearman (ρ) = 0,73, R2 = 0,6), pero no para la técnica SESA (p = 0,18, ρ = 0,36, R2 = 0,21).

Al comparar los parámetros de los espermatozoides frescos, los espermatozoides recolectados por EM tuvieron una mejor motilidad (mediana 80,0%, IQR 88,0-65,0 y mediana 67,50%, IQR 72,5-52,5, respectivamente; p = 0,02). No se encontraron diferencias significativas para los demás parámetros de semen fresco investigados, ni para ningún parámetro post-descongelación (p > 0,05).

El estudio proporciona evidencia de que la recuperación y calidad de los espermatozoides del epidídimo es más eficiente con la técnica EM en comparación con la técnica SESA en el perro. Cuando se recolectan espermatozoides del epidídimo, el objetivo es maximizar la recuperación de los espermatozoides, ya que este suele ser el último intento de preservar los gametos de un individuo.

Criopreservación de Semen Canino y su Evaluación

La criopreservación de semen y su posterior utilización mediante inseminación artificial en caninos es una biotecnología reproductiva en pleno desarrollo. Los procesos de criopreservación provocan alteraciones de las membranas y del metabolismo celular de los espermatozoides. El estudio de la acción de diferentes sustancias adicionadas a los diluyentes, su efecto sobre la criopreservación del eyaculado y el desarrollo de nuevos protocolos de congelación, con el fin de obtener mejores resultados en relación a la supervivencia espermática y fertilidad del semen al descongelado, posibilitará en el futuro la aplicación frecuente de esta biotecnología.

Protocolo de Criopreservación

Todas las muestras se centrifugaron a 720 x g durante 5 min a 22 °C para desechar el sobrenadante y resuspender el gránulo de esperma en diluyente de congelación I (diluyente a base de ácido cítrico-glucosa TRIS que contiene 20% de yema de huevo), que contiene 3% de glicerol (Uppsala I), hasta una concentración de 400 × 106 espermatozoides/mL. A continuación, las muestras extendidas se enfriaron lentamente a 4 °C durante 90 min y se añadió diluyente de semen II, que contenía un 7% de glicerol y un 1% de pasta Equex STM (Uppsala II), para alcanzar una concentración de 200 × 106 espermatozoides/mL justo antes de la criopreservación. La descongelación se obtuvo sumergiendo las pajitas en un baño de agua tibia a 37 °C durante 30 s.

Algunos de los crioprotectores pueden fabricarse a base de compuestos presentes en nuestra rutina diaria, como por ejemplo la yema de huevo. Al congelar el semen alcanzamos temperaturas de -196ºC introduciéndolo en tanques que contienen nitrógeno líquido.

Efecto del Tampón de Lisis Eritrocitaria (ELB) en la Criopreservación

En otro estudio, se recolectaron ocho epidídimos de perros de más de 1 año de edad. Los espermatozoides del epidídimo se recolectaron por EM y se colocaron en tubos de halcón de 15 mL. La motilidad, viabilidad y morfología de los espermatozoides se evaluaron. A continuación, las muestras se dividieron en dos alícuotas iguales y se aplicaron dos protocolos de congelación diferentes:

1. Protocolo normalizado de congelación (grupo de control), donde ambas muestras se centrifugaron a 720x g durante 5 min a 22 °C, se eliminó el sobrenadante y el gránulo de esperma se resuspendió con diluyente de semen I y se enfrió a 4 °C durante 90 min.
2. Protocolo con 2 mL de ELB (10X RBC lysis buffer Multi-species, ThermoFisher Scientific, Estados Unidos). Las muestras de ELB se centrifugaron a 25,76 x g durante 5 min a 22 °C y el gránulo se resuspendió con 2 mL de DPBS y se centrifugó a 25,76 x g durante 10 min. Después de retirar el sobrenadante, el gránulo se resuspendió con diluyente de semen I y se enfrió a 4 °C durante 90 min.

Se evaluó la motilidad, viabilidad y morfología de los espermatozoides en las muestras posteriores a la descongelación. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares se determinaron con Nitroblue Tetrazolio (NBT), un compuesto de tetrazolio aromático nitrosustituido soluble en agua de color amarillo que reacciona con iones superóxido intracelulares para formar un formazano azul-negro en el citoplasma del espermatozoide. Se realizó una prueba de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) para evaluar la resistencia de los espermatozoides al estrés oxidativo, midiendo el nivel de malondialdehído (MDA), un producto final de la peroxidación lipídica.

Las muestras criopreservadas con el protocolo de congelación ELB tuvieron una motilidad menor que las muestras criopreservadas con el protocolo de congelación estándar (mediana 56,2%, RIC 60,0-48,7 y mediana 70,0%, RIC 72,5-63,1, respectivamente; p = 0,01). Además, las ROS intracelulares fueron mayores en las muestras criopreservadas con el protocolo de congelación ELB en comparación con el protocolo de congelación estándar (mediana 78,5%, IQR 81,2-75,5 y mediana 70,0% IQR 70,5-68,7, respectivamente; p = 0,04).

Biotecnología Reproductiva y la Inseminación Artificial en Perros

La biotecnología reproductiva es uno de los campos donde más se ha avanzado en los últimos años. La demanda de inseminación artificial en caninos ha ido creciendo durante los últimos años. Esto es debido a que ayuda a criadores y veterinarios a mejorar la reproducción en animales con mérito genético, ya sea por conservación de la raza o de forma afectiva. Esta técnica es cada vez más requerida, también por propietarios privados, que desean que sus mascotas se reproduzcan bajo control veterinario y evitar así partos complicados.

Inseminación Artificial en Perros

La inseminación artificial es una técnica de reproducción asistida que en veterinaria se viene usando en distintas especies desde hace mucho tiempo. De hecho, la primera inseminación artificial en perros que tuvo éxito se realizó en el año 1780. En los casi 2 siglos y medio transcurridos desde entonces se han producido importantes avances en el estudio de la reproducción canina. Estos avances permiten, por ejemplo, estimar con bastante fiabilidad el momento óptimo para la inseminación artificial. Además, es posible congelar y transportar semen de una parte del mundo a otra, evitando el desplazamiento de los animales a una estación de monta.

Indicaciones para la Inseminación Artificial

La mayoría de procedimientos de inseminación artificial en la especie canina se llevan a cabo por alguno de los siguientes motivos:

• Gran distancia geográfica entre el macho y la hembra.
• Existencia de requerimientos legales que dificulten el traslado de alguno de los animales.
• Dificultades físicas para llevar a cabo una monta natural con éxito por parte del macho o la hembra.
• Preocupación por la posible transmisión de enfermedades durante la monta.
• Ausencia de gestación tras montas naturales anteriores.

Determinación del Momento Óptimo de la Inseminación Artificial

La elección del momento de la inseminación artificial es crítica para el éxito del procedimiento. Esta decisión debería basarse en los resultados de las determinaciones hormonales, citología vaginal y examen vaginoscópico.

Pruebas Hormonales

• Hormona Luteinizante (LH): Se considera que el momento en que se alcanza el pico en la concentración de LH es el que marca cuando se producen todos los eventos reproductivos. Su valor se estima con base en la concentración de progesterona.
• Progesterona: Los niveles de progesterona se incrementan con el pico de LH y dicho incremento se mantiene a lo largo del estro y diestro temprano. Se considera que el periodo fértil de la perra va desde el día anterior a la ovulación (día del pico de LH) a 4 días después, siendo este el momento idóneo para la inseminación.

Citología Vaginal

El incremento los niveles de estrógenos a partir del proestro produce una hiperplasia vaginal que a nivel citológico se ve representado en un aumento de la cornificación de las células superficiales, así como en la presencia de células anucleadas. La presencia de neutrófilos y células parabasales indica el final del periodo fértil.

Examen Vaginoscópico

El examen vaginoscópico permite observar los profundos cambios que se producen en la vagina durante el celo. En el proestro hay presencia de profundos pliegues edematosos en la mucosa vaginal. En el estro, hay un aplanamiento de los pliegues a medida que se reduce la concentración de estrógenos y aumenta la progesterona tras el pico de LH. La reducción de la hipertrofia e hiperplasia de la mucosa confiere a la vagina un aspecto “adoquinado” que indica que la ovulación se ha completado y la perra está en su período fértil.

Obtención y Calidad del Semen para Inseminación Artificial

La obtención del semen puede hacerse mediante distintos métodos, pero en todos ellos es importante usar equipamiento estéril. Para aumentar el nivel de estimulación del macho puede ser útil realizar el procedimiento en presencia de una perra en celo.

Fracciones del Eyaculado Canino

En el eyaculado del perro se distinguen 3 fracciones, que se aconseja almacenar por separado:

1. La primera fracción es de origen prostático, no contiene espermatozoides y se obtiene a medida que el macho logra una erección completa.
2. Cuando los movimientos pélvicos finalizan se obtiene la segunda fracción, que es rica en espermatozoides y tiene un volumen aproximado de 0,5-1,5 ml.
3. Una vez que el fluido se vuelve más claro, se inicia la expulsión de la 3ª fracción, también de origen prostático, con los nutrientes necesarios para el mantenimiento de los espermatozoides en el canal reproductor de la hembra.

Una vez obtenida la muestra, esta puede usarse inmediatamente, refrigerarse o congelarse. Las muestras frescas o refrigeradas pueden usarse tanto para inseminaciones vaginales como uterinas, mientras que el semen congelado es exclusivo para inseminaciones uterinas.

Evaluación y Conservación del Semen

Es importante evaluar la calidad del semen antes de la inseminación. Si es necesario su transporte o van a pasar más de 2-3 horas hasta su utilización, es recomendable la adición de sustancias que contribuyan a preservar la viabilidad de los espermatozoides, así como la refrigeración de la muestra a 4 °C. Aunque en esa situación los espermatozoides podrían vivir 5-7 días, se recomienda que las inseminaciones en perros con semen fresco refrigerado se hagan en las 48 horas siguientes a la obtención. La inseminación con semen refrigerado se puede realizar de forma vaginal o intrauterina siendo necesario determinar el momento aproximado de la ovulación.

Si no se puede usar el semen refrigerado en el plazo, puede recurrirse a la congelación de las muestras en nitrógeno líquido (previa adición de crioprotectores y sustancias tampón) a -196 °C y almacenamiento de en bancos de semen. Mediante este procedimiento, la viabilidad de las muestras se considera “ilimitada”.

El éxito de la inseminación artificial en perros depende en gran medida de elegir el momento y método adecuados para su realización, así como de la calidad del semen a utilizar. La cantidad de anomalías presentes en ellos de forma individual, lo que aporte una predicción del factor de fertilización y de la capacidad de supervivencia a la congelación.

Técnicas de Inseminación Artificial en Perros

En la literatura veterinaria puede encontrarse una amplia descripción de los diversos métodos de inseminación en perras. De modo general, se distinguen los siguientes:

1. Inseminación vaginal: El semen se deposita en la porción más craneal de la vagina, usando un catéter de plástico rígido o uno con balón.
2. Inseminación transcervical o uterina: El semen se deposita en el útero. Puede realizarse por el método noruego, por endoscopia o por laparoscopia. Aunque la inseminación quirúrgica fue descrita como la técnica de inseminación artificial más usada en perros, actualmente se considera un procedimiento no ético y está prohibida por la legislación de varios países.

Las posibilidades de que la inseminación artificial en perros tenga éxito son mayores con la inseminación uterina (hasta el 90%) que con la vaginal. Es importante una curva de aprendizaje previa para llevar a cabo estos procedimientos con garantías. En algunos países existe la tendencia a realizar 2 inseminaciones separadas 24-48 horas para maximizar las posibilidades de éxito, aunque algunos autores opinan que una inseminación uterina realizada en el momento óptimo es suficiente.

Servicios Especializados en Reproducción Canina

Centros como los del Grupo UNAVETS ofrecen servicios reproductivos integrales para el control de la reproducción canina. Esto incluye:

• Examen completo de la hembra: control previo a la cubrición, control del ciclo sexual (citológico y progesterona), diagnóstico de gestación, manejo y control del parto.
• Exploración física y anamnesis del macho reproductor, chequeo seminal, recolección y evaluación seminal, manejo del semen: procedimientos de conservación (refrigeración, congelación seminal).

Clinican, en Girona, es el único representante en exclusiva para España del sistema CLONE USA de congelación y refrigeración de semen canino. Este sistema exclusivo (KIT CLONE) tiene un ratio de efectividad en la concepción que puede llegar hasta un 94,2%. Una de las ventajas de este sistema permite la preparación de semen refrigerado para inseminaciones a distancia, eliminando la necesidad de desplazamientos.

El semen descongelado puede llegar a sobrevivir en capacidades fecundativas completas hasta 3 días después de la descongelación (si se mantiene en refrigeración), debido al efecto protector que ejerce sobre el esperma el exclusivo diluyente. El semen preparado con los diluyentes CLONE mejora su calidad debido a que se eliminan las sustancias y líquidos que componen el eyaculado, y conserva exclusivamente los espermatozoos.

Ricard Córdoba, fundador del primer banco de esperma canino de España en 1997 (Unidad de Reproducción Canina de Catalunya), ofrece este servicio especializado.

Otros centros, como la Clínica Veterinaria Puerto Venecia en Zaragoza y el Instituto Médico-Veterinario de Álava (IMVA), también ofrecen servicios especializados, incluyendo:

• Inseminación vaginal, transcervical o endoscópica.
• Refrigeración y congelación seminal, con kits de refrigeración para envío de semen.
• Disposición de BANCO DE SEMEN con catálogo de sementales de élite.
• Estudios completos del ciclo reproductivo y del reproductor, incluyendo análisis hormonales, patógenos reproductivos y función prostática.
• Cesáreas programadas en incubadora.

Estos avanzados sistemas de reproducción no solo permiten reproducir animales de cualquier lugar del mundo, sino que también, gracias a los veterinarios, se asegura la salud del animal en todo momento. Con estos servicios de reproducción especializados, se mejora la capacidad reproductiva de los animales y se facilitan con seguridad partos complicados y la práctica de cesáreas.

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