En el ámbito de la mejora genética de plantas, especialmente en frutales de hueso y para la obtención de híbridos intergenéricos, el letargo o falsa dormancia de las semillas representa un desafío significativo. Las variedades de maduración temprana o extratemprana, altamente rentables comercialmente, a menudo producen embriones con un tamaño reducido en la madurez del fruto, lo que impide su germinación por métodos tradicionales. Para superar este obstáculo, las técnicas de cultivo de embriones in vitro se han convertido en herramientas esenciales, permitiendo el rescate y desarrollo de zigotos en condiciones artificiales.
Cultivo de Embriones en Frutales de Hueso (Prunus spp.)
La mejora genética en especies como el melocotonero se ha centrado históricamente en variedades de bajas necesidades de frío. Sin embargo, estas variedades de élite suelen presentar embriones pequeños y, por ende, una baja viabilidad de germinación natural. El cultivo de embriones aislados artificialmente ha permitido alcanzar tasas de germinación aceptables, aumentando el número de plantas viables y acortando los programas de mejora.
Desarrollo Histórico de la Técnica
La aplicación de esta técnica para aumentar la baja tasa de germinación de semillas de variedades de maduración precoz fue inicialmente documentada por Tukey (1933) en cerezo. Posteriormente, Blake (1939) la aplicó por primera vez en un programa de mejora genética de melocotonero. Smith, Bayley y Hough (1969) propusieron un protocolo y un medio de cultivo (medio SBH) más adaptado al melocotonero, que con los años ha sido perfeccionado en aspectos como la esterilización, medios de cultivo, estratificación y condiciones de cultivo, como lo evidencian trabajos de Ramming (1985, 1990) y Emershad y Ramming (1994).
Protocolos Mejorados de Cultivo
Esterilización
Para simplificar el método de esterilización y reducir costos y riesgos, Ramming (1990) logró un nivel de contaminaciones casi nulo abriendo el fruto y el hueso para extraer la semilla y flameándola dentro de la cabina de flujo laminar tras inmersión en alcohol de 96º. Es crucial que el flameado se realice con el extremo micropilar del embrión apuntando hacia el flujo de aire de la cabina para evitar daños. Comparaciones realizadas por Espiau (1996) mostraron que la esterilización por flameado es tan eficaz como el uso de lejía comercial al 10% durante 20 minutos, obteniendo en ambos casos germinaciones similares.
Medios de Cultivo y Estratificación
El medio WPM (Woody Plant Medium; Lloyd y McCown, 1975) ha demostrado ser altamente efectivo, logrando porcentajes cercanos al 100% de plantas germinadas y una buena supervivencia con embriones de entre 5-10 mm de longitud, lo que corresponde al 25-50% de ocupación de la semilla (Hamill et al., 2005). En cuanto a la estratificación, la comparación de embriones maduros de melocotonero a 4 °C durante diferentes períodos mostró que una estratificación de 60 días resulta en una mayor supervivencia de las plantas (Espiau, 1996).
Cultivo de Óvulos
Las variedades extratempranas de melocotonero y nectarina desarrollan embriones de aproximadamente 1 mm cuando el fruto está maduro. Para estas variedades, el cultivo de óvulos se ha perfeccionado mediante la evaluación de diferentes medios, soportes y orientaciones del embrión, lo que ha llevado a porcentajes de germinación y trasplante a tierra de hasta el 90% (Ramming et al., 2003). Los frutos se esterilizan mediante inmersión en etanol al 70% y posterior lavado en hipoclorito de sodio al 0,525% con Tween 20.
En este estado temprano de desarrollo, la composición nutritiva del medio de cultivo es de vital importancia, ya que el desarrollo del embrión es heterótrofo y requiere una fuente rica en azúcares y vitaminas. Después de la incubación, los óvulos se extraen asépticamente, se abren y los embriones se transfieren a un medio SBH o WPM, dependiendo de si su tamaño está por encima o por debajo de 10 mm (Rubio-Cabetas et al., 1997; Rubio-Cabetas y Espiau, 2010). La combinación del cultivo de óvulos y el posterior cultivo de embriones es la solución recomendada cuando la maduración ocurre antes de los 65 días después de la floración (DDF) o cuando el tamaño del embrión no supera los 5 mm. Si la maduración es posterior a los 65 DDF o los embriones superan los 5 mm, el cultivo de embriones con medio WPM es suficiente.
Rescate de Embriones en Híbridos Intergenéricos (Helianthus annuus x Tithonia rotundifolia)
La hibridación intergenérica entre el girasol cultivado Helianthus annuus y la especie silvestre Tithonia rotundifolia presenta un gran potencial para el desarrollo de nuevos cultivares ornamentales, combinando características deseables de ambas especies. Sin embargo, la eficiencia de cruzamiento es baja y la mayoría de las semillas obtenidas están mal desarrolladas y carecen de capacidad de germinación, lo que subraya la importancia de las metodologías de rescate de embriones para la producción masiva de híbridos.
Metodología del Cultivo de Embriones Inmaduros
El rescate de embriones inmaduros en cultivo de tejidos ha tenido mayor éxito utilizando una secuencia de tres medios basados en el de Murashige-Skoog (1962). Los embriones inmaduros se obtienen de semillas mal desarrolladas del híbrido (13 y 22 días después de la polinización). Para su desinfección, se utilizan alcohol etílico al 70% seguido de hipoclorito de sodio al 1.2% de cloro activo, y enjuagues con agua estéril desionizada.
- Medio I (Germinación): Contiene aminoácidos (como fuente de nitrógeno orgánico) y el regulador de crecimiento BAP. Los embriones desinfectados se extirpan y se incuban en oscuridad de 6 a 8 semanas a 24 °C ± 2 °C.
- Medio II (Micropropagación): Sin aminoácidos y con BAP. Una vez que los embriones comienzan a desarrollarse en plántulas, se transfieren a este medio bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad por 2 a 4 semanas.
- Medio III (Enraizamiento): Sin vitaminas y con el regulador de crecimiento ANA (ácido naftalacético). Para la inducción de raíces, se probaron ocho medios con diferentes reguladores de crecimiento y aditivos.
La técnica de rescate de embriones puede ser modificada en la etapa de enraizamiento, basándose en el medio B5 (Gamborg et al., 1968), que ha sido aplicado con éxito en híbridos de Helianthus por Chandler y Beard (1983) y en Helianthus annuus por Freyssinet y Freyssinet (1988). Se pueden realizar modificaciones en la concentración del regulador de crecimiento, la cantidad de sacarosa y la concentración de agar para evitar problemas como la hiperhidratación. Una vez obtenida la raíz, las plantas se someten a tratamientos bactericidas/fungicidas (p. ej., Cuprimicin 500) y fortalecedores de raíz (p. ej., Raizal® 400) antes de ser transferidas a macetas con una mezcla de peat-moss/vermiculita y arena para su aclimatación, inicialmente bajo cubierta plástica y gradualmente expuestas a la humedad ambiental.
Resultados y Desafíos en la Aclimatación
En experimentos con 86 embriones, la emergencia de plántulas fue limitada (3 plántulas en 6 semanas, 5 más en 8-9 semanas), y un número significativo de ellas (7 de 8) fue descartado debido a hiperhidratación, una condición disfuncional asociada al estrés oxidativo, causada por alta humedad y agua libre en los sustratos que dificulta la transpiración. A partir de la plántula sobreviviente, se lograron 130 micropropagadas en buenas condiciones.
Para la inducción de raíces, el Medio 4 (MIIIA sin vitaminas y con 0.0001 g/l de ANA) fue el más efectivo, logrando enraizamiento en el 52% de las plantas. Otros medios con ausencia de vitaminas o altas concentraciones de reguladores de crecimiento no fueron exitosos. A pesar del éxito en la etapa in vitro, la aclimatación de las plantas enraizadas a condiciones de invernadero sigue siendo un desafío. De 20 plantas aclimatadas, solo dos se desarrollaron, y una de ellas alcanzó una floración inconclusa. Esto indica la necesidad de estandarizar las condiciones de aclimatación, incluyendo la prueba de diferentes mezclas de sustratos y soluciones nutritivas bajo ambientes controlados. Se recomienda explorar el uso de retardantes, la aplicación foliar de giberelinas o aminoácidos (que regulan el contenido hídrico y actúan como catalizadores de crecimiento), y modificaciones en la intensidad de luz.
