El cultivo celular es una técnica fundamental que permite el análisis directo de las células vivas bajo un microscopio. Su utilidad radica en la capacidad de estudiar el efecto aislado de moléculas sobre un tipo específico de célula o tejido, así como detectar anomalías en el número y la morfología de los cromosomas que pueden estar relacionadas con enfermedades genéticas.
Las células vivas pueden mantenerse y estudiarse fuera del cuerpo, lo que tiene gran utilidad para el estudio del efecto aislado de las moléculas sobre un tipo de célula o tejido. El cultivo de tejidos se considera una mezcla de ciencia y arte.
Existen diversas áreas de investigación dependientes de las técnicas de cultivo celular, incluyendo virología, investigación del cáncer, inmunología, ingeniería de proteínas y estudios de interacción.
Diagnóstico Prenatal Citogenético a partir de Líquido Amniótico
El diagnóstico cromosómico fetal mediante el cultivo de las células fetales descamadas del líquido amniótico es el método más utilizado en el diagnóstico prenatal citogenético (DPC). Este es un componente indispensable de los programas preventivos en genética impulsados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y constituye la principal modalidad en Cuba para realizar estudios cromosómicos prenatales. Su objetivo es establecer de forma precoz la existencia de una anomalía cromosómica fetal.
Las anomalías cromosómicas representan la causa principal de enfermedad genética, generando una gran proporción de pérdidas reproductivas, malformaciones congénitas y retraso mental.
Estudios de Poliploidías en Cultivos de Líquido Amniótico
El análisis de las poliploidías está bien establecido en el cultivo de sangre periférica. Sin embargo, se reportan frecuencias variables de células poliploides en el cultivo de líquido amniótico, las cuales pueden ser muy particulares para cada tipo de célula de este fluido. Debido a las condiciones artificiales del cultivo donde deben desarrollarse las células del líquido amniótico, en ocasiones se producen errores en los mecanismos de control de la mitosis, que ocasionan fenómenos de cambios en el complemento cromosómico y no reflejan el cariotipo real del feto.
Metodología de un Estudio Descriptivo Transversal en Camagüey
Un estudio descriptivo transversal se realizó en el Centro Provincial de Genética Médica de Camagüey, en el periodo de noviembre de 2016 a abril de 2018. La población de estudio estuvo constituida por 1571 muestras útiles de líquido amniótico obtenidas por amniocentesis en gestantes en el segundo trimestre. Estas gestantes fueron evaluadas en consulta multidisciplinaria con criterios clínicos de estudios cromosómicos, según lo establecido en el diagnóstico prenatal citogenético, previo consentimiento informado.
Se utilizaron 20 mL de líquido amniótico para la siembra de células fetales, aplicando tres variantes de cultivo abierto: directo, centrifugado y expandido. En cada variedad se determinó el complemento cromosómico.
Amniocentesis
Células del Líquido Amniótico
El éxito del cultivo de líquido amniótico se define por la presencia de células en crecimiento a las dos o tres semanas de la siembra, lo cual ocurre en el 85% de los cultivos. El pleomorfismo celular es un rasgo característico del líquido amniótico. Inicialmente, se observan células de gran tamaño con morfología poligonal, junto con células pequeñas con morfología redondeada, que son las que predominan. Esta situación cambia a los varios días de cultivo con la desaparición de las células poligonales y el crecimiento progresivo de otras células con morfología fibroblastoide. La cantidad de células en una muestra es bastante baja antes de la semana 12 de gestación, aumentando progresivamente hacia la semana 15. Así, desde la semana 12 a la 20 hay un incremento del 50%, descendiendo a continuación.
Índices de Medición en el Cultivo Celular
- Índice Mitótico (IM): Mide la actividad proliferativa celular directamente en la sección histológica elegida. Se refiere específicamente al número de células que se expresa como una fracción del total. Se mide como número de mitosis por el número de campos que el investigador decida (10 campos).
- Índice de Poliploidías (IP): Mide la aparición de poliploidías directamente en la sección histológica elegida. Se refiere al número de células poliploides (≠2n) expresado como una fracción del total de células con complejo cromosómico normal (=2n).
Resultados del Estudio de Camagüey
En el estudio de Camagüey, predominó el complemento cromosómico normal. Las tetraploidías prevalecieron en el cultivo expandido. El cariotipo normal fue predominante y las tetrapolidías fueron las alteraciones más frecuentes, prevaleciendo en el cultivo expandido. El índice mitótico fue similar en las tres variedades de cultivo y el cultivo directo tuvo el más bajo índice de poliploidías.
Frecuencia de Células con Cariotipo Normal y Poliploidías
- Las células con cariotipo normal aparecieron con una frecuencia relativa del 97.70 %.
- Solo se observaron 433 células poliploides en el cultivo directo, representando menos del 3 % de la muestra. De estas, las tetraploides se observaron en todos los frascos (2.28 %), mientras que células triploides solo hubo 2 (0.01 %) en los frascos de cultivo 1 y 2.
- El 95.84 % de las células tenían un cariotipo normal, mientras que las células poliploides estuvieron confinadas a menos del 5 %, con las triploidías representando el 0.10 % y las tetraploidías el 4.04 %. Estas alteraciones numéricas del complemento cromosómico aparecieron en todos los frascos de cultivo.
Análisis por Variedad de Cultivo
- En el cultivo centrifugado, las células tetraploides fueron las más frecuentes de las poliploidías (2.96 %) y aparecieron en todos los frascos de cultivo. Solo se observaron células triploides en el frasco 1, representando el 0.03 % del mismo.
- En todos los cultivos prevaleció el cariotipo normal, siendo la variante expandida la de menor frecuencia (32.4 %) y con menos figuras mitóticas (32.8 %).
- El mayor índice mitótico fue 9.6 en el cultivo centrifugado y de 9.3 en la totalidad de las muestras.
- En cuanto al índice de poliploidías, en el cultivo directo fue de 2.3, mientras que en la variedad de cultivo expandido este índice alcanzó casi el doble (4.3).
Estudios Comparativos y Antecedentes
En décadas pasadas, estudios realizados en laboratorios de citogenética de Zaragoza arrojaron resultados concluyentes donde las alteraciones numéricas fluctuaban en un rango entre 0.10 % y 0.30 % dentro de las alteraciones cromosómicas. Ribate Molina en la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza también coincide en que las cromosomopatías numéricas tienen prevalencia sobre las estructurales, a pesar de su baja aparición en las poblaciones de estudio.
Un estudio realizado en el Laboratorio de Citogenética del Centro Provincial de Genética Médica de Camagüey por Pimentel Benítez, en un periodo de 20 años sobre los resultados del diagnóstico prenatal citogenético a partir de líquido amniótico, obtuvo que el 25.62 % eran aberraciones numéricas. Resultados similares se plantean en el Manual de Citogenética Teórico Práctico del 2015, donde la aparición de células tetraploides es común en las preparaciones a partir de líquido amniótico.
Los resultados de esta investigación en Camagüey coinciden con un estudio realizado en Costa Rica, en el cual el 3.97 % de las metafases de los cultivos de líquido amniótico son tetraploides y se pueden encontrar en más de un frasco de cultivo. El estudio de Camagüey sobre el fenotipo mixoploide refiere la baja frecuencia de poliploidías en los estudios prenatales, y las triploidías son infrecuentes e incompatibles con la vida del niño si el embarazo llega a término.
Otra investigación obtiene resultados similares, pero no los relacionan con las variantes de cultivo aplicadas; de 625 cariotipos fetales obtenidos, 570 fueron normales y solo 55 tuvieron alteraciones numéricas. Datos similares refiere el manual de Córdoba de 2015, que expone que las células tetraploides o triploides son infrecuentes, a pesar de realizarse estudios prenatales citogenéticos en muestras amplias y de varios años. La baja aparición de las triploidías también se reporta por International Clearinghouse for Birth Defects Surveillance and Research y la Universidad de Zaragoza. El reporte realizado por International Clearinghouse for Birth Defects Surveillance and Research del 2015 y las investigaciones de Gómez-Puente, en la Facultad de Medicina y Hospital Universitario, UNAL, coinciden en la aparición de células poliploides en cultivos celulares, teniendo mayor frecuencia las triploidías.
En Camagüey, se han obtenido resultados similares a los de esta investigación, demostrándose la baja frecuencia de estas alteraciones. En 2015, Pimentel solo detectó un caso de alteración numérica del complemento cromosómico, coincidiendo con el primer caso en Cuba de mixoploide diploide/triploide diagnosticado en el periodo prenatal. Esa baja frecuencia de poliploidías no se reporta en México, por la Facultad de Medicina y Hospital Universitario, en un estudio de 7 años realizado por Gómez-Puente, et al.; en él se muestra que dentro de las alteraciones cromosómicas estructurales, la más frecuente fue la presencia de alteraciones numéricas, que correspondieron al 77 % de 249 muestras.
En Cuba, el grupo de investigaciones del Centro de Genética Nacional declara que en una serie de estudio en 10676 diagnósticos prenatales citogenéticos analizados, existieron bajos porcentajes con alteraciones numéricas, solo el 0.04 %. Chen CP, en Taiwán, hace referencia al fenómeno de la endorreduplicación que puede surgir debido al cultivo en un medio artificial, siempre por debajo del 3 % de las células en metafase, pero no al índice de poliploidías que pueden aparecer en los mismos.
En América, estudios como el de Silva en Colombia y Garibay en México abordan las características del cultivo celular en el diagnóstico prenatal citogenético; sin embargo, no reflejan los índices de aparición de poliploidías en los cultivos. Lo mismo ocurre en investigaciones de Saurat en Francia, que alega la aparición de alteraciones numéricas en los cultivos celulares, pero no los índices de poliploidías.
En un estudio citogenético realizado en la provincia de Las Tunas en Cuba, las trisomías fueron las cromosomopatías numéricas más frecuentes. Investigaciones en Cuba refieren que algunos cambios en la estructura, y en especial el número de los cromosomas detectados durante el análisis citogenético, no están asociados con defectos clínicos, lo que representa una disyuntiva para el asesor genético, principalmente durante la realización de un estudio prenatal.
En la bibliografía analizada, no se hace referencia a estos índices en los cultivos de células del líquido amniótico, solo a la frecuencia de aparición de células poliploides o con cariotipo normal.
Anomalías Cromosómicas y Diagnóstico Prenatal
Las anomalías cromosómicas tienen una prevalencia del 8% en la concepción y del 0,6% en el nacimiento, siendo la primera causa de pérdidas embrionarias y fetales del primer trimestre. El diagnóstico prenatal agrupa todas aquellas acciones diagnósticas encaminadas a descubrir durante el embarazo un defecto congénito, entendiendo por tal toda anomalía del desarrollo morfológico, estructural, funcional o molecular presente al nacer (aunque pueda manifestarse más tarde), externa o interna, familiar o esporádica, hereditaria o no, única o múltiple.
La detección temprana de anomalías cromosómicas resulta una necesidad en el control prenatal actual. Estas técnicas se clasifican en no invasivas e invasivas.
Técnicas No Invasivas y Pruebas Invasivas
En las técnicas no invasivas se utilizan métodos bioquímicos o ecográficos que permiten estudiar marcadores susceptibles de variación en aquellos embarazos con alteraciones morfológicas o genéticas, y técnicas basadas en el estudio del ADN fetal libre circulante en sangre materna. Las pruebas invasivas, por otro lado, requieren invadir el espacio o entorno fetal para conseguir las muestras que se utilizarán para el estudio prenatal, aumentando el riesgo de interrupción del embarazo.
Las pruebas invasivas en el diagnóstico genético prenatal son: amniocentesis, biopsia del corion y cordocentesis.
Momentos y Riesgos de las Pruebas Invasivas
El momento gestacional para realizar las pruebas invasivas varía en función de la técnica. Para obtener un diagnóstico lo más temprano posible, entre las semanas 10 y 13 de embarazo se recurre a la biopsia corial. Esta puede ser a través del cuello del útero (transcervical) o a través de la pared abdominal (transabdominal). Existe un riesgo del 1% de rotura prematura de membrana e infección de líquido amniótico, pudiendo conllevar a la pérdida fetal. Esta técnica lleva asociados riesgos de contaminación materna por no haber tomado una muestra representativa, resultados no concluyentes por mosaicismos confinados a placenta o contaminación microbiana que causa el fallo del cultivo in vitro.
La amniocentesis como procedimiento de diagnóstico prenatal invasivo de segundo trimestre se realiza a partir de la semana 16 de gestación con un riesgo de pérdida fetal del 0,5%. No está indicado realizar amniocentesis antes de la semana 15 por la posibilidad de no existir fusión entre la membrana amniótica con el corion, donde el riesgo se triplica. Además, existen otras complicaciones como la pérdida de líquido amniótico (0,3%), hemorragia placentaria, infección intraamniótica, hematoma de la pared abdominal o traumatismo fetal.
Cultivo y Proliferación de Fibroblastos Fetales
En un estudio retrospectivo realizado en el Hospital Universitario Rio Hortega de Valladolid en 2019, se analizaron un total de 232 muestras de líquido amniótico de gestantes de edades comprendidas entre 14 y 46 años. Para el cultivo y proliferación de los fibroblastos fetales presentes en el líquido amniótico se usaron 3 recipientes de cultivo de 25 cm² de superficie con tapón de filtro ventilado. El proceso de incubación se realizó a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO2 hasta la formación de nuevas colonias, aproximadamente de siete a nueve días tras su siembra.
Los cultivos se levantaron con tripsina-EDTA al 0,05% para su procesamiento cuando alcanzaron una confluencia del 80% o de 4 a 6 células en metafases por campo. Posteriormente, en el proceso de obtención de metafases se utilizó Colcemid a una concentración de 10 mg/mL, inhibiendo la formación del huso acromático y consiguiendo parar los cromosomas en la fase de metafase, donde se encuentran más condensados.
Una vez obtenidas las metafases, se extendieron en un portaobjetos de cristal, se envejeció durante un mínimo de 16 horas y se tiñó con la técnica de bandas GTG (patrón de bandas G) usando tripsina en PBS 1/20 (desde la solución madre a 0,25%) y el colorante Leishman. En el análisis citogenético se estudiaron 20 metafases con una resolución de 400 a 450 bandas por caso, entre dos facultativos, con la captura automática de metafases mediante MetaSystem Metafer y usando el programa de gestión de imágenes Ikaros (versión 5.3, MetaSystems).
Análisis de Grupos de Estudio por Semanas Gestacionales
Se establecieron grupos de estudio en función de la semana gestacional para que la comparación entre las muestras de los líquidos amnióticos fuera equitativa en términos de cantidad de células, ya que cuanto más avanzada sea la semana gestacional, mayor número de amniocitos. Se excluyeron 6 muestras con semanas gestacionales mayores a la semana 24+0 por no formar un grupo lo suficientemente grande para el estudio comparativo. Además, de las comparaciones por semanas gestacionales, se realizaron comparaciones atendiendo al sexo y patología cromosómica en cada grupo.
En el análisis estadístico se utilizó la prueba t-Student para determinar las diferencias de promedios de las variables independientes de las muestras de líquido amniótico con resultado citogenético normal y patológico de cada grupo, teniendo en cuenta el sexo cromosómico. El nivel de significancia usado fue p<0,05.
De los 52 líquidos amnióticos con resultados patológicos, 47 presentaron un número anómalo de cromosomas al cariotipo (aneuploides), siendo el más prevalente el Síndrome de Down con 33 casos. La edad media de las gestantes fue de 35 años.
De las 226 muestras de líquido amniótico que entraron en el estudio:
- 63 (27,9%) estaban entre las semanas gestacionales 15+0 -15+6 (Grupo 1).
- 116 (51,3%) pertenecían a las semanas gestacionales 16+0-16+6 (Grupo 2).
- 41 (18,14%) pertenecían a las semanas gestacionales comprendidas entre 17+0 y 22+6 (Grupo 3).
Se consideró incluir en el mismo grupo a las muestras de la semana 17, 20 hasta la 22+6 por la disminución celular a partir de la semana 20, y por poder ser equitativos en términos de cantidad de células.
Estadísticos por Grupo y Tiempos de Cultivo
Analizando los estadísticos por grupo, se observa que en el grupo 1, el tiempo medio de cultivo de los líquidos amnióticos femenino sin patología fue de 19.16 días, mientras que en los patológicos fue de 19.22 con desviaciones típicas de 5.00 y 3.73 respectivamente.
En el grupo 3, el p-valor sí resultó estar por debajo del nivel de significación 0.05, pero este resultado espurio viene dado por un número de muestras de líquidos amnióticos bajo, por lo que no se puede considerar que dicha comparación sea representativa. Además, como este grupo abarca un rango mayor de semanas gestacionales, el número de amniocitos en las muestras de líquido amniótico puede ser susceptible de ser diferente si lo comparamos con los otros dos grupos.
Este estudio concluye que las anomalías cromosómicas visibles mediante técnicas de citogenética convencional en las muestras de líquido amniótico en los grupos estudiados no producen alteraciones en los tiempos de cultivo cuando se comparan con muestras sin patologías.
En los estudios con células madre embrionarias humanas sí existe una diferencia en las tasas de división en células aneuploides por haber una sobreexpresión de genes que inducen a la proliferación y crecimiento celular. Dichos genes se encuentran en los mismos pares cromosómicos donde se hallaron trisomías como la del par 8 o 11, confiriendo una ventaja adaptativa a las células en cultivo mediante un mecanismo de selección natural. Sin embargo, en el diagnóstico genético prenatal, los amniocitos ya presentaban alteraciones cromosómicas antes del cultivo y no fueron sometidos a una presión selectiva en el mantenimiento in vitro.
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