La evaluación de la viabilidad espermática es un componente crucial en el análisis seminal, especialmente cuando se busca comprender la calidad y el potencial fértil de una muestra de semen. Aunque la movilidad de los espermatozoides es un indicador de vitalidad, no todos los espermatozoides inmóviles están muertos, lo que hace necesario un estudio específico de su viabilidad.
La citometría de flujo se presenta como un método avanzado y objetivo para la evaluación espermática. Esta técnica permite identificar, cuantificar y separar espermatozoides en suspensión mediante el uso de marcadores con sustancias fluorescentes, denominados fluorocromos. Estos marcadores están dirigidos a componentes físicos y químicos específicos que se desean estudiar, como la viabilidad celular, la funcionalidad mitocondrial, la integridad del acrosoma y del material genético. Hoy en día, esta técnica ofrece la posibilidad de analizar múltiples características espermáticas en la misma muestra de semen de una forma rápida, precisa y objetiva.
Objetivos de la Evaluación Espermática con Citometría de Flujo
El objetivo general es el desarrollo de la técnica de laboratorio de Citometría de flujo con el fin de ver su evolución durante los últimos años, es decir, su implicación en nuevas aplicaciones como es el caso de la Espermatología, tanto a nivel de investigación como en un ámbito más comercial. Los objetivos específicos incluyen:
- Conocer las propiedades fisicoquímicas más importantes de los espermatozoides para así poder reconocer semen con un porcentaje fértil alto.
- Aprender los diferentes procesados del semen en diferentes especies (bovino/porcino).
- Conocer las aplicaciones más actuales en citometría de flujo para la obtención de semen sexado.
Métodos Tradicionales para Determinar la Vitalidad Espermática
Históricamente, la evaluación de la viabilidad de espermatozoides se ha basado en procedimientos microscópicos que utilizan métodos de tinción simples o duales. El test de vitalidad del esperma es una prueba realizada durante el seminograma en la que se calcula el porcentaje de espermatozoides vivos y muertos de una muestra de semen.
Test de Tinción con Eosina-Nigrosina
En la actualidad, la prueba de vitalidad espermática que más se utiliza en los centros de reproducción asistida es el test de eosina-nigrosina, también conocido como test de Williams Pollack. Para llevar a cabo esta metodología y determinar el porcentaje de espermatozoides que están vivos en una muestra de semen, se realiza una tinción de eosina-nigrosina en los espermatozoides.
Una característica de los espermatozoides muertos es la presencia de perforaciones y agujeros en sus membranas, por lo que son permeables al colorante eosina-nigrosina. De modo que, cuando se realice la tinción y se observe la muestra al microscopio, los espermatozoides muertos aparecerán teñidos de rojo o rosa. Por el contrario, la eosina-nigrosina no será capaz de penetrar en los espermatozoides vivos, puesto que su membrana está intacta. Por esta razón, los espermatozoides vivos aparecerán de color blanco.
Prueba Hipoosmótica
Otro estudio de vitalidad espermática, aunque utilizado en menor medida, es el test hipoosmótico. Esta prueba también está basada en la integridad de la membrana plasmática del espermatozoide. Los espermatozoides son diluidos con una solución hipotónica, lo que produce un desequilibrio osmótico entre el medio extracelular y el intracelular. Esto significa que el agua entrará o no en el interior de los espermatozoides en función de su vitalidad. Gracias a la reacción de los espermatozoides a esta solución, se puede distinguir:
- Espermatozoides vivos: intentan regular el desequilibrio provocado por la solución hipotónica entre el medio externo y el interior del espermatozoide. Para ello, los espermatozoides vivos incorporan agua al interior. Esto causa un aumento del volumen del espermatozoide y la cola del mismo se enrollará en forma de hélice.
- Espermatozoides muertos: la solución hipotónica no causa ningún efecto en los espermatozoides muertos. En este caso, la cola no se enrollará ni entrará agua al interior del espermatozoide.
La ventaja de esta técnica es que no mata a los espermatozoides, por lo que se pueden utilizar para un tratamiento de fertilidad. Por ello, el test hipoosmótico es una buena opción para muestras seminales con baja concentración espermática.
Limitaciones de los Métodos Tradicionales
En los métodos de tinción tradicionales, la confiabilidad de la prueba para la evaluación de la viabilidad espermática es cuestionable ya que se basan en una población relativamente pequeña (hasta 200 células por muestra) y la precisión durante la evaluación es subjetiva porque depende del observador.
La Citometría de Flujo: Un Enfoque Avanzado para la Viabilidad Espermática
¿Qué es la Citometría de Flujo en Espermatología?
La Citometría de flujo es un método que trata de identificar, cuantificar y separar los espermatozoides en suspensión, utilizando marcadores con sustancias fluorescentes denominados fluorocromos. Estos marcadores están dirigidos a los componentes físicos y químicos que se pretenden estudiar.
Los estudios de espermatozoides con citometría de flujo se dirigen principalmente a determinar espermatozoides portadores de cromosomas X e Y con el fin de diagnosticar enfermedades ligadas al sexo, así como evaluar la viabilidad celular, la funcionalidad mitocondrial y la integridad del acrosoma y del material genético. La separación espermática por citometría de flujo de los espermatozoides X e Y es actualmente el único método eficaz para la obtención de descendencia de sexo deseado.
Fluorocromos Específicos para la Viabilidad Espermática: SYBR-14 y PI
En las últimas décadas se están utilizando los fluorocromos SYBR-14 e ioduro de propidio (PI) para determinar la viabilidad espermática en diferentes especies. El SYBR-14 es permeable a la membrana y tiñe el ADN de los espermatozoides vivos con fluorescencia verde. Por otro lado, el PI solo puede atravesar la membrana de espermatozoides muertos o con membrana dañada y teñir su ADN con fluorescencia roja. Estos fluorocromos se han utilizado para evaluar semen fresco y descongelado de mamíferos y aves.
La evaluación de la viabilidad espermática por citometría de flujo proporciona un método rápido, objetivo y preciso al momento de evaluar el porcentaje de espermatozoides vivos, superando las limitaciones de la microscopía de fluorescencia, que es muy laboriosa y demandante de tiempo.
Estudio de Caso: Viabilidad Espermática en Alpacas y el Impacto de la Criopreservación
Un estudio se realizó para determinar el porcentaje de viabilidad en espermatozoides obtenidos de epidídimo de alpaca mediante citometría de flujo, antes y después del proceso de criopreservación, dado que la criopreservación de semen ofrece la posibilidad de almacenamiento por un largo periodo, pero la alta viscosidad del plasma seminal y la mala calidad de los eyaculados son desventajas para el desarrollo de una técnica de congelación. Además, no existían estudios contundentes sobre cómo la criopreservación afecta la viabilidad espermática en esta especie.
Objetivo y Metodología del Estudio
El estudio se realizó en el Laboratorio de Reproducción Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima, Perú). Se recolectaron 46 testículos de alpaca de un camal y se utilizaron 41 de ellos con motilidad espermática >30% y concentración espermática >50x106 espermatozoides/ml.
Procedimiento:
- Los espermatozoides fueron recuperados de la cola del epidídimo con 1 ml de dilutor a base de leche descremada.
- Se separaron en dos alícuotas para evaluar la viabilidad antes y después del proceso de criopreservación.
- El dilutor fue retirado mediante lavados por centrifugación con PBS, y los pellets fueron resuspendidos en 100 µl de PBS.
- Se agregó 0.5 µl de SYBR-14 (100 nM) y 0.5 µl de ioduro de propidio - PI (12 µM), incubándose por 10 min a 38 °C. Se empleó el LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit (L-7011, Molecular Probes).
Evaluación por Citometría de Flujo:
La evaluación de viabilidad espermática se realizó mediante citometría de flujo con analizador de imágenes (FlowSight, Amnis, USA). Se leyeron 10 000 eventos compatibles con espermatozoides por cada muestra. Se utilizó un láser de excitación de 488 nm, y la fluorescencia emitida por el SYBR-14 (verde) y el PI (rojo) fue detectada por los canales Ch02 (505-560 nm) y Ch05 (642-740 nm), respectivamente. Los espermatozoides viables con membrana intacta emitieron fluorescencia verde (SYBR-14) y los espermatozoides no viables con membrana dañada emitieron fluorescencia roja (PI). El citómetro de flujo, al poseer un sistema analizador de imágenes, permitió observar fotos de espermatozoides vivos marcados con SYBR-14 y muertos marcados con PI.
Análisis Estadístico:
Los porcentajes de viabilidad fueron analizados mediante la prueba de t-Student de muestras pareadas. La correlación entre los porcentajes de viabilidad y motilidad se determinó con el coeficiente de correlación de Pearson.
Resultados Clave
- La viabilidad antes del proceso de criopreservación (48.97 ± 11.47%) fue significativamente mayor (p<0.05) que después del proceso de criopreservación (32.30 ± 9.57%).
- La correlación entre viabilidad y motilidad espermática fue r=0.6737, indicando una correlación moderada positiva significativa.
- Los valores porcentuales de viabilidad y motilidad de los espermatozoides antes y después del proceso de criopreservación fueron estadísticamente diferentes (p<0.05).
Discusión y Conclusiones del Estudio
Este estudio fue el primero en presentar cómo los porcentajes de viabilidad en espermatozoides obtenidos de epidídimo de alpaca disminuyen significativamente luego del proceso de criopreservación. La viabilidad espermática inicial estuvo alrededor del 48%, y en las muestras descongeladas se observó una disminución de la viabilidad espermática que llegó hasta 32%.
La mayor pérdida de espermatozoides viables en algunos estudios anteriores podría deberse al dilutor empleado (etilenglicol), mientras que en el presente estudio se utilizó dimetilacetamida (DMA). Esto sugiere que algunos de los factores involucrados en mantener la viabilidad espermática en alpacas serían los crioprotectores y los antioxidantes.
La motilidad inicial de 46% descendió hasta 24% luego del proceso de congelación. Se reconoce que la motilidad es el parámetro más afectado durante el proceso de congelamiento y que se encuentra estrechamente relacionada con la viabilidad espermática. Es por eso que una disminución en la motilidad espermática a menudo se interpreta como un indicador de la disminución en la viabilidad. Sin embargo, en este estudio se encontró un mayor porcentaje de espermatozoides vivos que móviles, lo cual es posible porque existen espermatozoides viables que no poseen motilidad. Esto explica que, aunque los espermatozoides no viables no tienen motilidad, no se puede concluir que los espermatozoides viables tendrán necesariamente motilidad.
En conclusión, el proceso de criopreservación disminuye significativamente la viabilidad en espermatozoides epididimarios de alpaca, estando este parámetro relacionado con la motilidad. Existe una correlación moderada positiva entre la viabilidad y motilidad espermática de espermatozoides de alpaca.
Criterios de Normalidad y Alteraciones: La Necrozoospermia
Una vez determinada la metodología a aplicar para valorar la vitalidad espermática, es fundamental conocer que se deben evaluar al menos 200 espermatozoides para obtener resultados fiables. La Organización Mundial de la Salud (OMS) en su Manual de Laboratorio para el Examen y Procesamiento del semen (sexta edición, 2021), dictamina que a partir de un 58% de espermatozoides vivos se considera que la muestra seminal es normal. En cambio, si el índice de vitalidad es menor al 58%, la vitalidad espermática está alterada y la muestra de semen tiene una elevada cantidad de espermatozoides muertos.
Por tanto, cuando el porcentaje de espermatozoides muertos en una muestra espermática es superior al 42% se conoce como necrozoospermia. Se trata de una de las posibles causas de infertilidad masculina debida a un factor espermático.
Causas Frecuentes de Necrozoospermia:
- Estrés.
- Consumo de alcohol, drogas o mala alimentación.
- Tratamientos oncológicos.
- Infecciones en el tracto urinario.
- Trastornos hormonales.
- Elevado periodo de tiempo de abstinencia sexual.
Opciones de Tratamiento
La necrozoospermia no tiene un tratamiento específico que evite la muerte de los espermatozoides. No obstante, siempre se recomienda al hombre llevar un estilo de vida adecuado, reducir el periodo de abstinencia o incluso tomar suplementos alimenticios. Para aquellos pacientes con necrozoospermia que desean ser padres, se recomienda recurrir a una fecundación in vitro (FIV) con inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). De esta forma, solo se necesitará una pequeña cantidad de espermatozoides vivos.
¿Cómo recoger correctamente la muestra de semen para un seminograma?
Preguntas Frecuentes sobre la Viabilidad Espermática
¿Se puede mejorar la vitalidad espermática?
Sí. Los hábitos saludables son la mejor manera, así como evitar tóxicos (el tabaco, plásticos, etc.). Además, la toma de oligoelementos y antioxidantes puede mejorar la movilidad del esperma. En concreto, las nueces, los tomates y los espárragos son buenos alimentos para conseguir esto. Por otro lado, existen múltiples polivitamínicos en el mercado destinados a mejorar la vitalidad espermática y se pueden obtener con facilidad en las farmacias.
¿Cómo se determina la vitalidad espermática?
La vitalidad espermática es el test que nos indica el número de espermatozoides vivos presentes en una muestra de eyaculado. Principalmente, el análisis de la vitalidad espermática se realiza a través de dos metodologías:
- Tinción con eosina: es el análisis más extendido entre la mayoría de las unidades de reproducción asistida. Consiste en, mediante una serie de procesos de fijación y coloración, distinguir los espermatozoides vivos de los que no lo están mediante la coloración que presenten. El fundamento se basa en la absorción de diferentes tinciones, eosina en este caso, por parte de las células muertas, de tal modo que al realizar el conteo observaremos espermatozoides no teñidos (vivos) y espermatozoides teñidos (muertos), expresando dicho resultado en porcentaje tras haber contado al menos 200 células.
- Prueba hipoosmótica: basada en la característica de semipermeabilidad de las membranas y sus variaciones en medios de distinta osmolaridad.
¿Cuánto duran los espermatozoides vivos en el cuerpo de la mujer?
Tras la eyaculación vaginal, los espermatozoides pueden sobrevivir en el organismo de la mujer un tiempo máximo de 4-5 días. Las condiciones en la mujer son similares a las del hombre y por ello el esperma puede sobrevivir.
¿Cuánto duran los espermatozoides vivos en el preservativo o en la mano?
Las condiciones externas no son favorables a los requerimientos del esperma y por ello, si la eyaculación es externa, los espermatozoides mueren en pocas horas. Por esta razón, es tan importante intentar mantener las condiciones de temperatura y luz durante la obtención de la muestra seminal para un seminograma o un tratamiento de reproducción asistida.
¿Qué precio tiene el test de vitalidad del semen?
La prueba de vitalidad de los espermatozoides no suele realizarse de manera rutinaria en el seminograma. Es más habitual realizarla cuando se observa que hay un porcentaje elevado de espermatozoides inmóviles, más del 60%; es decir, no suele realizarse si hay al menos un 40% de espermatozoides móviles. En caso de que se realice el test de vitalidad en el seminograma, el precio suele estar incluido y el precio del seminograma puede oscilar entre los 50 a 170 euros.
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