La eficiencia en la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos y la mejora de las tecnologías de transferencia embrionaria (TE) son objetivos cruciales en la zootecnia moderna. Las técnicas in vitro, que a menudo emplean ovocitos de cerdas prepúberes obtenidas de matadero, permiten evaluar parámetros clave como la fecundación y el desarrollo embrionario. Para la criopreservación de ovocitos y embriones, se utiliza comúnmente el sistema SOPS (Straw Open Pulled System) para vitrificación y calentamiento, mientras que para las técnicas in vivo, la detección del estro y la inseminación artificial preceden a la recolección y evaluación de embriones.
Introducción a la Producción y Criopreservación de Embriones Porcinos
La posibilidad de criopreservar material genético mediante la vitrificación de gametos brinda una alternativa fundamental para perpetuar las especies y preservar la diversidad genética. En el porcino, la ausencia de tecnologías eficaces para la criopreservación de ovocitos puede conducir a una pérdida de diversidad genética y obstaculizar el uso de biotecnologías reproductivas.
Vitrificación como Estrategia de Criopreservación
La vitrificación se define como la transición de soluciones acuosas de un estado líquido a un estado vítreo sólido sin formación de cristales, aunque su estructura molecular sea la de un líquido extremadamente viscoso. Esta técnica es un proceso rápido y fácil de realizar, lo que la convierte en un método indispensable en criobiología.
Los factores que mejoran el impacto de la vitrificación sobre los ovocitos o embriones incluyen el volumen de la solución de vitrificación y la alta concentración de crioprotectores utilizados. La disminución del volumen ha permitido obtener mejores resultados debido al paso más rápido por la zona de temperatura peligrosa (entre +15 y -5ºC), lo que produce menores daños por enfriamiento. Las altas concentraciones de crioprotectores evitan la formación de hielo y disminuyen el daño causado por enfriamiento, ya que reducen la temperatura a velocidades muy rápidas (2,500°C/min). Sin embargo, esto también puede incrementar las probabilidades de lesionar las células debido al choque osmótico y la toxicidad de los crioprotectores.
Competencia Oocitaria y Maduración In Vitro
Por sus similitudes fisiológicas con los humanos, los cerdos pueden ser utilizados como modelos en investigaciones biomédicas y para la creación de animales genéticamente modificados, como potenciales donadores de tejidos y órganos para xenotrasplantes. Estas biotecnologías requieren de la producción in vitro de ovocitos madurados y cigotos de buena calidad.
In vivo, la capacidad para la fertilización y el desarrollo se adquiere por los ovocitos después de un largo periodo de crecimiento y desarrollo, un proceso que involucra tanto la síntesis de componentes citoplasmáticos como la reordenación y reducción de los cromosomas. La competencia meiótica, es decir, la capacidad de los ovocitos para reiniciar y completar la meiosis, se adquiere progresivamente durante el crecimiento del folículo y ovocito. En condiciones de cultivo in vitro, la maduración en algunos casos es deficiente por causas aún no identificadas, aunque se considera que el tamaño del ovocito y la comunicación intercelular entre el ovocito y las células del cúmulo son importantes para su maduración.
Los estados de maduración meiótica de los ovocitos pueden influir en su capacidad para sobrevivir a la criopreservación. La vitrificación de ovocitos en estado de vesícula germinal (VG) podría tener ventajas, ya que los microtúbulos aún no están organizados en forma de huso y el material genético está dentro del núcleo protegido por la membrana nuclear. No obstante, los índices de supervivencia de ovocitos vitrificados en estado de VG son todavía muy bajos en el bovino y porcino. Se ha observado que los ovocitos porcinos en estado de metafase II (MII) son muy sensibles a la vitrificación, con alteración localizada en los microtúbulos y organización mitocondrial. Además, el gran contenido de gotas de lípidos, característico de los ovocitos de esta especie, dificulta su vitrificación.
Los hallazgos sugieren que el proceso de vitrificación disminuye la viabilidad de los ovocitos para su posterior desarrollo. Por ello, es importante conocer la viabilidad al momento del calentamiento (desvitrificación) para establecer protocolos de investigación que mejoren los resultados del desarrollo posterior a la vitrificación en ovocitos porcinos. La combinación de crioprotectores permeables y no permeables puede incrementar el porcentaje de supervivencia. Por ejemplo, el etilén glicol (EG) actúa como crioprotector de penetración rápida, reduciendo el cambio de volumen y el tiempo de exposición para completar el equilibrio osmótico, aunque en alta concentración o exposición prolongada puede producir daño excesivo. Por su parte, la trehalosa tiene características favorables para la estabilización de proteínas y la doble capa de fosfolípidos de las membranas biológicas, ejerciendo una acción protectora contra el frío y un efecto osmótico.
Desvitrificación - Laboratorio IVI
Estandarización de la Clasificación Morfológica de Ovocitos Inmaduros
Los criterios de clasificación de ovocitos porcinos inmaduros no están estandarizados, lo que resalta la necesidad de seleccionar aquellos más aptos para madurar in vitro. El objetivo principal de una investigación fue establecer una clasificación morfológica de los ovocitos inmaduros y evaluar el índice de recuperación, viabilidad, estadio nuclear y porcentaje de maduración de cada clase.
Metodología y Clases de COCs
Los complejos ovocito-cumulus (COCs) inmaduros se clasificaron de acuerdo con las características del cúmulus. La viabilidad se evaluó combinando Azul Tripán y diacetato de fluoresceína, y el estadio nuclear con Hoechst 33342. La maduración se realizó en medio 199 y se evaluó por la presencia de metafase II. Se establecieron 6 clases de COCs:
- A1: cúmulus íntegro denso y oscuro.
- A2: cúmulus íntegro denso y claro.
- B1: corona radiata.
- B2: ovocitos parcialmente desnudos.
- C: ovocitos desnudos.
- D: cúmulus de células picnóticas.
Resultados de la Clasificación
La recuperación de COCs por ovario (33,40±2,43) y por folículo (0,76±0,02) fue superior en hembras sin servicio respecto a hembras adultas (10,00±2,52 y 0,56±0,08; P<0,05). Sin embargo, las proporciones de cada clase no difirieron entre las dos categorías de hembras. Los porcentajes de distribución de las clases fueron: A1 (20,9%), A2 (20,0%), B1 (16,0%), B2 (14,6%), C (26,0%) y D (2,6%).
Los porcentajes de ovocitos vivos en las clases A1 (93,0%) y A2 (88,6%) fueron superiores a los de las otras clases (P<0,05). El porcentaje de vesícula germinal entre las clases fue similar (65-71%), a excepción de la clase D (50%; P<0,05). No se observó relación entre el porcentaje de ovocitos vivos y el porcentaje de vesícula germinal en cada una de las diferentes clases.
Los porcentajes de maduración meiótica (A1 51,7%; A2 58,0%; B1 54,4%; B2 52,5%; C 37,3% y D 0,0%) están relacionados con los porcentajes de ovocitos vivos en estadio de vesícula germinal. En cambio, no hubo relación con cada parámetro por separado (P<0,05).
Como conclusión, los ovarios de hembras sin servicio serían más convenientes para recolectar un mayor número de ovocitos inmaduros.
Evaluación Experimental de la Viabilidad de Ovocitos Porcinos Vitrificados
Un estudio específico tuvo como objetivo evaluar la viabilidad de ovocitos porcinos inmaduros (VG) y madurados in vitro (MII) después de la vitrificación, utilizando etilén glicol y trehalosa como crioprotectores y el sistema SOPS como contenedor. Se recolectaron 503 ovarios, de los cuales se obtuvieron 731 ovocitos por aspiración de folículos de 3 a 5 mm. Estos se dividieron en tres grupos experimentales.
Metodología del Estudio
Los ovarios de cerda se transportaron al laboratorio y se lavaron. Los COCs se aspiraron de folículos de 3 a 5 mm y se seleccionaron aquellos con citoplasma uniforme y rodeados de una masa compacta de células del cúmulus.
El diseño experimental consideró clasificar a los COCs en tres grupos:
- Grupo 1 (Control): Maduración in vitro de ovocitos.
- Grupo 2: Vitrificación de ovocitos en estado de VG y maduración después del calentamiento.
- Grupo 3: Vitrificación de ovocitos madurados in vitro (MII).
Se realizaron siete ensayos por grupo.
Grupo 1: Control (Maduración In Vitro)
Una vez obtenidos, los COCs se lavaron y se cultivaron in vitro en un medio comercial de maduración TCM-199 suplementado con D-glucosa, Piruvato de Sodio, PVA, Cisteína, EGF, FSH y LH (usando Merional). Se incubaron a 38.5ºC con 5% de CO2 en aire y humedad a saturación por 44 horas. Después de la maduración in vitro, las células del cúmulo se removieron con hialuronidasa, y los ovocitos se fijaron y tiñeron con orceína al 1% en ácido acético al 45% para evaluar su estadio de maduración:
- No madurados: Sin cromatina visible o con vesícula germinal (VG).
- En proceso de maduración: Con cromatina condensada o metafase I (MI).
- Madurados: Con metafase II (MII) y cuerpo polar.
Vitrificación y Calentamiento de Ovocitos
Los ovocitos de los grupos 2 y 3 se vitrificaron utilizando un protocolo de dos pasos (equilibrio y vitrificación). Los ovocitos seleccionados se lavaron y se transfirieron a un medio de equilibrio que contenía TCM-199, etilén glicol (EG) 4% y suero fetal bovino (SFB) 20% durante 15 minutos. Posteriormente, se colocaron en una solución de vitrificación (TCM-199, EG 30%, SFB 20% y trehalosa 0.4 M) por 20 segundos. Luego se colocaron en una pajilla extrafina (SOPS) para su vitrificación y se sumergieron directamente en nitrógeno líquido.
El calentamiento (desvitrificación) se realizó una semana después a 37°C. Los ovocitos se colocaron en un medio TCM-199 con 10% de SFB y tres concentraciones decrecientes de trehalosa (0.3 M, 0.2 M, 0.1 M y 0.0 M) durante 3 minutos en cada pozo. Posteriormente, se lavaron 3 veces en TCM-199 suplementado con 10% SFB. El cultivo de ovocitos en estado de VG calentados (Grupo 2) fue similar al del grupo control.
Evaluación de Viabilidad
Para evaluar la viabilidad, los ovocitos se colocaron en una caja de Petri y se les añadió azul tiazolil (MTT). Transcurridas 2 horas, se observó la tinción: los ovocitos viables presentaron una coloración azul, mientras que los no viables no mostraron coloración. Este procedimiento se realizó en tres momentos:
- En ovocitos frescos (recién colectados).
- En ovocitos al momento del calentamiento (desvitrificación).
- En los ovocitos calentados después de 44 horas de cultivo in vitro.
Resultados del Estudio Específico
Los resultados de maduración en el Grupo 1 (control) mostraron que el 44% de los ovocitos permanecían en estado de VG, el 23% en estado de MI (cromatina condensada o metafase I) y el 33% alcanzaron MII.
En el Grupo 2 (vitrificación de ovocitos en VG), la viabilidad en fresco fue del 100%. Al momento del calentamiento, la viabilidad fue del 76%, pero a las 44 horas de cultivo in vitro después del calentamiento, se redujo al 13%.
Los ovocitos del Grupo 3 (vitrificación de ovocitos madurados in vitro), antes de la vitrificación, presentaron una viabilidad del 94.8% y, después del calentamiento, del 50%.
Conclusiones del Estudio de Vitrificación
Aunque la viabilidad es mayor al momento del calentamiento en los ovocitos inmaduros (VG) que en los maduros (MII), estos últimos pueden presentar una mayor ventaja para el desarrollo posterior en la reproducción asistida. Esto se debe a que en los ovocitos inmaduros la viabilidad se reduce significativamente al cultivarlos por 44 horas para su maduración in vitro. Los efectos tóxicos de los medios de vitrificación sobre ovocitos en estadio de VG fueron mínimos en ausencia de vitrificación, y similares para ambas combinaciones de agentes crioprotectores.
Además, se ha demostrado que se pueden obtener blastocistos de alta calidad mediante la vitrificación de ovocitos inmaduros. La interacción de las gonadotropinas (Gns) con los tres inhibidores reversibles de la meiosis (dbcAMP, cicloheximida y cilostamida) aceleraron la progresión meiótica hasta el estadio de MII. Sin embargo, bajo las condiciones experimentales evaluadas, la suplementación del medio de IVM/IVF/IVC con Ácido Ascórbico (AsA) a una concentración de 50 µg/mL no mejoró los resultados de la PIV de embriones.
Factores que Influyen en la Proliferación y Supervivencia Embrionaria en Porcinos
La fertilidad y prolificidad son dos parámetros directamente relacionados en la reproducción porcina. Generalmente, buenas tasas de fertilidad van acompañadas de alta prolificidad, mientras que bajas fertilidades suelen asociarse con camadas poco numerosas y desiguales.
Factores Relacionados con la Hembra
En aproximadamente el 70% de las cerdas, la duración del estro es de 48-72 horas, con el reflejo de inmovilidad frente al verraco iniciándose entre 2 y 25 horas desde el primer signo externo del celo. La máxima ovulación ocurre aproximadamente 36-44 horas después del inicio de la inmovilización, con muy poca ovulación antes de las 24 horas.
Las menores tasas de ovulación se asocian a cerdas nulíparas, aunque estas se incrementan con la edad. El tamaño de la camada en primerizas y a lo largo de su vida productiva está influido por la edad en el momento de la primera cubrición y por el número de celos antes de la concepción. Las líneas genéticas comerciales no tienen las mismas tasas de ovulación, las cuales dependen de las razas que componen la F-1 y el tipo de cruce. Este aspecto también hace referencia al predominio anabólico o catabólico en el animal al momento de la ovulación; cerdas a las que se les permite pasar un celo se recuperan del catabolismo y presentan tasas de ovulación superiores.
La hembra ejerce una acción directa y primordial sobre la viabilidad embrionaria al ser la anfitriona del producto de la concepción. Para que la gestación se desarrolle sin alteraciones, son necesarias transformaciones en las condiciones del útero y el estado fisiológico general de la cerda.
En las nulíparas, el efecto sobre la prolificidad del número de celos previos a la primera concepción se explica por la elongación del aparato genital tras cada celo, lo que determina un mayor espacio uterino y, por lo tanto, una menor reabsorción embrionaria, más que por un aumento de la tasa de ovulación. El mayor tamaño de camada de algunas razas, como la Meishan, es consecuencia de un mayor tamaño del útero que determina una menor muerte embrionaria, y no de una mayor tasa de ovulación.
Factores Genéticos y del Embrión
Las anormalidades cromosómicas existentes en el cerdo se asocian con intersexualidad y mortalidad embrionaria. El número de estas anormalidades varía entre las distintas razas y líneas genéticas, oscilando entre el 0,1% y el 0,6%, aunque algunos verracos individualmente pueden alcanzar el 5%. También existen problemas de prolificidad asociados a la presencia de un gen en homocigosis, como el relacionado con el complejo de histocompatibilidad.
La viabilidad de los embriones difiere según procedan de progenitores puros o híbridos, debido al diferente nivel de heterosis de los mismos y del embrión formado. La mejora en la viabilidad del lechón parece ser debida al mayor vigor híbrido del embrión procedente de un cruzamiento, así como al ambiente uterino que la cerda híbrida le ofrece. Los embriones más desarrollados y de mayor tamaño tienen más probabilidad de sobrevivir que los menos desarrollados.
Factores Ambientales y de Manejo
Diversos factores externos pueden influir en la viabilidad de los ovocitos y el éxito reproductivo:
- Deficiencias Nutricionales: La carencia de calcio, fósforo, vitamina A, E, zinc, cobre, yodo, entre otros, puede impactar negativamente.
- Temperatura (Estrés Térmico): Es uno de los factores más importantes, afectando tanto la fertilidad como la prolificidad en machos y hembras. La espermatogénesis se ve influenciada negativamente a partir de los 29ºC, y temperaturas superiores a los 30ºC incrementan los porcentajes de reabsorción embrionaria.
- Sistemas de Sujeción en Gestación: Sistemas como la collera o cincha pueden generar incomodidad y un estado de estrés permanente en la cerda.
- Cojeras: La presencia de un alto número de hembras con problemas de aplomos, cojeras o lesiones en las pezuñas empeora sensiblemente el resultado reproductivo de la explotación.