Introducción al Cribado Neonatal y la Importancia de la Precisión Analítica
Los programas de cribado neonatal son esenciales en Salud Pública, reconocidos en los sistemas sanitarios como herramientas fundamentales para la prevención. Su objetivo es identificar a recién nacidos (RN) con presuntas patologías graves, permitiendo un diagnóstico y tratamiento temprano que puede prevenir discapacidades asociadas a la enfermedad. La toma de muestra se realiza típicamente con sangre capilar o venosa, recogida directamente en papel absorbente en forma de manchas, que contienen de 50 a 80μL. Debido al elevado número de personas involucradas en este proceso, el riesgo de errores preanalíticos es considerable, lo que subraya la necesidad de recomendaciones específicas por parte de organismos como el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)5.
Origen y Evolución de los Programas de Cribado Neonatal (PCN)
Los inicios del cribado neonatal se remontan a la década de los años 60 con el desarrollo de una prueba bacteriológica, conocida como el test de Guthrie2. Esta prueba era capaz de detectar una elevación de los niveles de fenilalanina en una gota de sangre seca recogida en papel de filtro. El momento de realización de los PCN ha evolucionado, desde una muestra única tomada al 2º o 3er día de vida, hasta estrategias con muestra doble (a las 24 horas y a partir del 5º día de vida).
Criterios Fundamentales para la Inclusión de Trastornos
Clásicamente, se definieron criterios para la inclusión de un trastorno en el cribado masivo4: la gravedad de la enfermedad, que debe cursar con morbilidad (como retraso mental) o mortalidad si no se diagnostica en el período neonatal; la existencia de un tratamiento eficaz; una frecuencia de la enfermedad relativamente elevada (al menos, 1 de cada 10.000-15.000 RN); y la disponibilidad de un método analítico de cribado rápido, fiable y de bajo coste. Aunque estos criterios permanecen vigentes, la incorporación de nuevas tecnologías ha flexibilizado algunas de estas consideraciones.
El Rol de la Espectrometría de Masas en Tándem (MS/MS)
La introducción de la espectrometría de masas en tándem con electrospray (ESI-MS/MS) en los laboratorios de cribado en los últimos 10 años ha condicionado cambios significativos, permitiendo la identificación simultánea de una gran cantidad de enfermedades metabólicas (más de 40 ECM) en una misma muestra. Esta tecnología ha dado lugar al denominado cribado metabólico expandido. La alta sensibilidad de la MS/MS ha permitido adelantar la toma de muestras, lo que es crucial, ya que anteriormente se requería que el niño hubiera ingerido alimentación durante al menos 4-5 días.
Enfermedades Incluidas en los PCN en España
En España, se recomienda realizar el cribado neonatal en muestra de sangre impregnada en papel para al menos ocho entidades:
Hipotiroidismo Congénito (HC)
El HC tiene una importancia extraordinaria por su potencial repercusión sobre el desarrollo intelectual del niño, ya que las hormonas tiroideas son imprescindibles para el desarrollo cerebral. Es la causa de retraso mental prevenible más frecuente, con una frecuencia de 1/3.500 RN vivos. El cribado sistemático se basa en la determinación del nivel de TSH (tirotropina) en sangre, que, por definición, está siempre elevado (≥ 10µUI/ml) en el hipotiroidismo primario. El tratamiento precoz, iniciado dentro del primer mes de vida, se asocia a coeficientes de inteligencia dentro de la normalidad.
Fenilcetonuria (PKU)
La PKU es el paradigma de los errores innatos del metabolismo (EIM) incluidos en los PCN. Es una enfermedad del metabolismo de la fenilalanina (Phe) que se transmite de forma autosómica recesiva, con una prevalencia de 1/12.000-1/18.000 RN. El cribado se realiza midiendo la Phe y tirosina (Tyr) en sangre por MS/MS.
Trastornos de la Beta Oxidación Mitocondrial
Estos incluyen la deficiencia de acil CoA deshidrogenasa de ácidos grasos de cadena media (MCADD) y la deficiencia de 3-hidroxi acil CoA deshidrogenasa de ácidos grasos de cadena larga (LCHADD). Son enfermedades de los ácidos grasos que se transmiten de forma autosómica recesiva. Como consecuencia, se acumulan ácidos grasos y sus derivados conjugados (acilcarnitinas y acilglicinas), lo que da lugar a problemas fisiopatológicos y un defecto de energía.
Aciduria Glutárica Tipo I (AG-1)
La AG-1 es una enfermedad del metabolismo de los ácidos orgánicos causada por un defecto de la enzima GCDH, con una prevalencia en España de 1/85.000 RN. Esta enzima metaboliza la lisina (Lys) y el triptófano (Trp). Su deficiencia provoca el bloqueo de la reacción y la acumulación de compuestos tóxicos para el sistema nervioso.
Deficiencia de Biotinidasa (BTD)
El BTD es un error congénito del metabolismo que, si no se trata, se caracteriza por convulsiones, dificultad para respirar, hipotonía, erupciones cutáneas, alopecia y retraso en el desarrollo. La prevalencia del déficit clínico se estima en 1/61.000. El tratamiento consiste en suplementos de biotina oral de por vida, que mejoran los síntomas y previenen su aparición.
Proceso de Toma y Manejo de Muestras de Sangre en Papel
Aunque las estrategias de obtención de muestras biológicas pueden diferir, la norma general recomienda una extracción única de sangre capilar a partir de las 48 horas de vida del RN, tras una ingesta de 24 horas de alimento. La extracción de sangre capilar debe ser realizada exclusivamente por personal sanitario, siendo la punción del talón el procedimiento habitual.
Recomendaciones para la Extracción de Sangre Capilar
- Para minimizar el dolor, se recomienda administrar lactancia materna, soluciones de glucosa o chupetes impregnados en sacarosa durante el procedimiento.
- La punción debe realizarse con lanceta estéril con punta < 2,4 mm en la porción medial o lateral de la superficie plantar del talón para evitar daños osteo-articulares.
- Se debe masajear el pie previamente para aumentar el flujo sanguíneo en la zona y desinfectar con alcohol de 70º, evitando derivados iodados.
- Después de la punción, la primera gota de sangre debe limpiarse con una gasa estéril. Luego, se deja que se forme una nueva gota grande de sangre y que esta caiga sobre el papel absorbente, llenando el círculo por completo con una sola aplicación.
Debe aplicarse la sangre solamente en uno de los lados del papel, examinando ambos lados para asegurarse de que la sangre haya traspasado uniformemente el papel. Para que la muestra sea óptima, las manchas de sangre deben contener, al menos, 75 μl (aproximadamente 13 mm de diámetro) y deben dejarse secar en una superficie horizontal no absorbente, seca y limpia durante, al menos, una hora a temperatura ambiente, evitando la luz solar directa.
Consideraciones Post-Extracción y Envío de Muestras
Las muestras, una vez obtenidas, deben enviarse al laboratorio lo antes posible, preferiblemente dentro de las 24-48 horas siguientes a la extracción. Es crucial evitar el contacto entre las muestras, utilizando un papel separador si es necesario, y también evitar tocar o manchar las gotas de sangre con agua, desinfectantes, jabones o alcohol, para prevenir contaminaciones e interferencias. Aunque el cribado se realiza habitualmente en sangre, también es posible realizar estudios a partir de muestras de orina en papel de filtro, utilizando técnicas como MS/MS o cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC/MS), lo que permite confirmar diagnósticos, complementar información o ampliar a nuevos diagnósticos.
Impacto de Errores Preanalíticos y Situaciones Especiales
La examinación visual de las manchas de sangre solo detecta los errores más graves. Merecen especial atención situaciones como las transfusiones previas, que obligan a realizar una toma de muestra a las 48-72 horas post-transfusión y repetirla a los 120 días. En RN con patología grave al nacimiento, se recomienda tomar una muestra al ingreso y repetirla a las 48-72 horas. Para los alimentados parenteralmente, la muestra debe tomarse a las 48-72 horas después de iniciar la alimentación enteral.
El Problema de las Interferencias: Enfoque en el Ácido Etilendiaminotetraacético (EDTA)
En el contexto del cribado neonatal, la precisión analítica es primordial. Sin embargo, la presencia de ciertas sustancias en las muestras puede comprometer la fiabilidad de los resultados.
Interferencias de Anticoagulantes en Métodos de Medida
Es conocido que la presencia de anticoagulantes como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el citrato sódico en la muestra de sangre puede producir interferencias en algunos métodos de medida6, como los fluorimétricos (FIA) e inmunofluorimétricos (IFMA). No existe una forma visual de reconocer las muestras recogidas con anticoagulante, lo que impide su descarte y aumenta la posibilidad de resultados falsos negativos o positivos.
Efecto Específico del EDTA en la Determinación de Tirotropina (TSH)
En el caso de los inmunoensayos que utilizan anticuerpos marcados con europio, como el sistema AutoDELFIA® (técnica utilizada en los laboratorios de cribado neonatal en España), la unión se realiza con derivados del EDTA. Cuando la muestra misma lo contiene, se produce una liberación de europio como consecuencia de la reacción de equilibrio durante la incubación7. Esta interferencia puede originar elevaciones de la 17-hidroxi-progesterona, causando resultados falsamente positivos en programas endocrinológicos. De manera similar, podría afectar negativamente las medidas de tirotropina (TSH)8, un marcador clave para el cribado neonatal del hipotiroidismo congénito, provocando un falso negativo.
Aunque el EDTA permite una mejor recuperación de algunos analitos como el plomo sanguíneo9, se recomienda, de forma general, su no utilización en la toma de muestra para cribado neonatal.
Desarrollo y Optimización de un Método de Espectrometría de Masas en Tándem (MS/MS) para la Detección de EDTA
Ante la dificultad de reconocer visualmente la presencia de EDTA en las muestras, se hizo necesario desarrollar un método analítico que permitiera su detección.
El objetivo de un estudio realizado fue el desarrollo y optimización de un método por espectrometría de masas en tándem (MS/MS) para la determinación de EDTA en muestras de sangre impregnada en papel. Posteriormente, se analizó la influencia de este anticoagulante sobre la medida de la hormona TSH, medida con el sistema AutoDELFIA®, y se valoró la inclusión de este método en el perfil de aminoácidos y acilcarnitinas utilizado para la detección precoz neonatal de enfermedades metabólicas.
Materiales, Reactivos y Aparatos Utilizados
Para el estudio se utilizó agua obtenida con un sistema Milli-Q y EDTA Merk ref. 8418. Se empleó una mezcla de isótopos estables de aminoácidos y acilcarnitinas de Cambridge Isotope Laboratories (CIL), incluyendo 13C6-Fenilalanina. El análisis se realizó con un espectrómetro de masas en tándem API 2000 ESI-MSMS (AB SCIEX) acoplado a un HPLC Perkin-Elmer Series 200. La fase móvil estuvo compuesta por acetonitrilo LiChrosolv Merck y agua en proporción (70:30) con ácido fórmico al 0,05%. Los resultados fueron adquiridos con el software Analyst versión 1.4 y procesados con Chemoview 1.4. Para la butilación de aminoácidos se empleó butanol clorhídrico 3N Sigma-Aldrich-Fluka. Las determinaciones de TSH se realizaron con un equipo de fluorescencia para inmunoensayos automatizado AutoDELFIA® mod. 1235 (Wallac Oy, Perkin-Elmer Turku Finlandia), y también con un equipo de quimioluminiscencia ADVIA Centaur® (Siemens Healthcare).
Protocolo de Calibrado y Preparación de Patrones de EDTA
La optimización de los parámetros del espectrómetro de masas se realizó mediante infusión constante de 60μL/min de una disolución del butil éster del EDTA. Este compuesto se obtuvo a partir de una disolución acuosa de EDTA de concentración 7 mmol/L, derivatizada con butanol clorhídrico 3N para bloquear el grupo ácido y formar un butil éster que favorece la ionización positiva. Para el cálculo de la curva de calibración del EDTA se prepararon disoluciones acuosas de 1, 3, 4, 5 y 7 mmol/L. El método es lineal en el rango de estudio, y la recuperación analítica se situó entre el 91-108% (rango habitualmente aceptado entre 90-110%). El límite de detección fue de 43μmol/L y el límite de cuantificación de 84μmol/L10.
Optimización de Parámetros del Espectrómetro de Masas
Se trabajó con ionización en modo positivo. Se determinó el ión precursor en el primer cuadropolo (Q1) y se optimizaron los parámetros DP (Declustering Potencial), FP (Focusing Potencial) y EP (Entrance Potencial) para maximizar la sensibilidad. Una vez fragmentado el compuesto en la célula de colisión (Q2), se seleccionó el ión producto mayoritario y se optimizaron los parámetros CE (Collision Energy) y CXP (Collision Cell Exit Potencial) en el tercer cuadrupolo (Q3). De esta forma, la transición optimizada fue: (m/z 517,3→ 272,2).
Posteriormente, se optimizaron los parámetros de la fuente: CUR (Curtain Gas), CAD (Collision Gas), GS1, GS2 y TEM (Temperatura). Los valores obtenidos para todos estos parámetros fueron registrados en las tablas 1 y 2, respectivamente, confirmando la validez del método para la determinación de este anticoagulante.
Determinaciones Concomitantes de Tirotropina y Preparación de Muestras
Se recogieron muestras de sangre con y sin EDTA cedidas voluntariamente por un grupo de pacientes, y se impregnaron papeles con estas muestras, a las que se les midió el hematocrito. Se realizaron las determinaciones de la TSH sérica y plasmática mediante quimioluminiscencia en el equipo ADVIA Centaur®, y también se determinó el hematocrito en el analizador ADVIA 2120. A las muestras de sangre impregnada en papel, con o sin EDTA, se les midió TSH utilizando un ensayo fluoroinmunométrico con AutoDELFIA®.
Para la medida de aminoácidos y acilcarnitinas, estos metabolitos fueron extraídos selectivamente de las muestras de sangre en papel mediante agitación en metanol, en el que se habían incluido patrones internos marcados isotópicamente. Este eluato fue sometido al mismo protocolo de derivatización descrito para los patrones de EDTA y finalmente introducido en el equipo de MS/MS.
Resultados y Discusión: Hallazgos sobre la Detección de EDTA y su Influencia
El método desarrollado y optimizado para la detección de EDTA se integró con éxito en los procedimientos de cribado neonatal.
Integración de la Detección de EDTA en el Perfil de Aminoácidos y Acilcarnitinas
Una vez desarrollado y optimizado el método, la transición del EDTA se añadió como un MRM (multiple reaction monitoring) al perfil de aminoácidos y acilcarnitinas utilizado para la detección precoz neonatal por ESI-MS/MS. Como patrón interno para la cuantificación del EDTA, se utiliza la [13C6] fenilalanina, ya incluida en el grupo de patrones internos del ensayo. Se ha observado que el fragmento de m/z 272,2, producido por el EDTA butilado, es el mismo que el de la acrililcarnitina en el ensayo de precursores de m/z 85,1. Esto implica que, si en el perfil de acilcarnitinas se incluye este MRM, también se podría, de forma indirecta, detectar la presencia de este anticoagulante en las muestras de sangre de cribado neonatal. Esta integración permite determinar la concentración de EDTA en todas las muestras de cribado sin coste adicional alguno.
Confirmación de la Influencia Negativa del EDTA en la Medida de TSH
Se realizó un estudio de correlación entre las medidas de TSH en suero, plasma y sangre en papel en un grupo de 97 pacientes. Se observó una disminución de los valores de TSH en las muestras plasmáticas en comparación con las de suero (pendiente 0,6997)11. El mismo efecto se observó en las muestras de sangre con EDTA impregnadas en papel, corregidas por el hematocrito, con una pendiente de 0,7875. Esta disminución se explica porque, al ser un inmunoensayo directo, el EDTA provoca una interferencia directa, a diferencia de los ensayos competitivos, donde podría causar una elevación7,12. Esto corrobora la influencia negativa del EDTA en la determinación de TSH mediante un fluoroinmunoensayo (AutoDELFIA®), lo que podría provocar un falso negativo en el cribado neonatal de hipotiroidismo congénito.
Se observó que algunas muestras de plasma (6) y sangre impregnada en papel (4) mostraron una concentración de TSH menor de la esperada. Esto podría justificarse si los tubos de extracción no se llenan completamente, resultando en una mayor concentración del anticoagulante (4,4 mmol/L en tubos llenos adecuadamente) y, por ende, una mayor interferencia en la medida de TSH12. Otra práctica inadecuada, como la reutilización de tubos capilares con EDTA, también podría ser una causa de la variabilidad en las concentraciones de TSH en las manchas.
Detección de EDTA en Muestras de Cribado Neonatal
Se midió la concentración de EDTA presente en 2.300 muestras de sangre en papel de recién nacidos por ESI-MS/MS. En 17 de ellas se comprobó que contenían EDTA en una concentración entre 1 y 6 mmol/L, lo que representa un 0,74% de las muestras estudiadas y, por tanto, en riesgo de producir interferencias que podrían llevar a resultados erróneos.
Gestión de Resultados Alterados y Acciones Post-Cribado
El propósito de los análisis utilizados en el cribado neonatal es identificar a todos los RN presuntamente positivos y clasificarlos respecto a la probabilidad de tener un trastorno concreto, con un mínimo aceptable de resultados falsos positivos. Los PCN no son procedimientos de diagnóstico definitivo, sino que identifican grupos de alto riesgo que requieren procedimientos diagnósticos posteriores. Para ello, los PCN deben integrarse con unidades clínicas y de laboratorio especializadas en el diagnóstico y tratamiento de cada enfermedad.
Clasificación y Comunicación de Resultados Anormales
- Resultados alterados, altamente sugestivos de una alteración metabólica grave: Se debe contactar lo antes posible con la familia, mediante llamada telefónica por parte de un profesional con experiencia en el manejo de enfermedades metabólicas. Idealmente, este clínico debería conocer la evolución, pronóstico y tratamientos disponibles, y ser capaz de explicar a los padres el significado del resultado y los pasos a seguir para confirmar o excluir el diagnóstico.
- Resultados fuera del rango normal, pero no tan alterados como para indicar una enfermedad: Estos casos sospechosos requieren una repetición del test para distinguir entre un verdadero positivo y una anomalía transitoria debido a la inmadurez del RN. Generalmente, la solicitud de una nueva muestra se realiza a través de una carta del laboratorio de cribado, explicando que el resultado inicial es anormal y que se necesita una muestra adicional para descartar un resultado positivo verdadero. Se aconseja a los padres acudir a su pediatra, quien es responsable de asegurar la repetición del test, proporcionar una explicación adicional y, si es necesario, indicar medidas especiales para el bebé.
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