Las células gliales, como las células de Schwann, oligodendrocitos, microglía y astrocitos, desempeñan un papel crucial en el sistema nervioso. Las células de Schwann, por ejemplo, son responsables de la formación de mielina alrededor de las fibras nerviosas en el sistema nervioso periférico, girando según se desarrollan alrededor de los axones. Las disfunciones en estas células pueden estar implicadas en diversas enfermedades y trastornos neurodegenerativos.
El estudio de estas células in vitro es fundamental para comprender su fisiología y patología. Sin embargo, los protocolos de cultivo tradicionales a menudo incluyen suero fetal bovino (SFB), que puede introducir variabilidad y complejidades en la investigación. Este artículo describe un protocolo para el cultivo de células gliales humanas, específicamente fibroblastos gingivales (FGs), en ausencia de SFB, evaluando su impacto en la supervivencia, crecimiento y expresión de marcadores celulares.
Importancia de los Fibroblastos Gingivales y el Desafío del SFB
Los fibroblastos son células constituyentes esenciales de los tejidos conectivos, participando activamente en la renovación de los componentes de la matriz extracelular (MEC) y en la homeostasis y reparación tisular. Los fibroblastos gingivales (FGs), células mayoritarias del tejido conectivo y responsables de la síntesis de los elementos de la MEC gingival, han sido objeto de un interés particular en los últimos años debido a su potencial regenerativo. Los componentes de la MEC, favorecidos por los FGs, hacen posible la creación de un microambiente que alberga células inflamatorias, vasculares e, incluso, las células madre del tejido gingival.
Morfológicamente, los FGs presentan un núcleo redondo y voluminoso, su forma es alargada y fusiforme, con proyecciones anatómicas hacia otros componentes de la MEC, con quien se interrelacionan. En estado activo, los FGs son capaces de proliferar y de generar la formación de un tejido de granulación luego de la síntesis de citoquinas, que participan en la respuesta inflamatoria del tejido gingival. A partir de la formación de este nuevo tejido, los FGs pueden recolonizar, migrar y diferenciarse, favoreciendo la síntesis de una nueva MEC. Por ello, los FGs autólogos podrían ofrecer un potencial tisular prometedor en la reparación de defectos patológicos sistémicos y de la cavidad oral.
La comprensión funcional de los FGs implica conocer las interacciones celulares y funciones que desempeñan las organelas celulares, aun cuando estas células son sometidas a condiciones particulares de cultivo in vitro. La utilización de medios de cultivos apropiados para suplir las necesidades metabólicas y funcionales de las células cultivadas son vitales para su supervivencia y proliferación. La variación del SFB puede influir en la morfología, la fisiología y las características bioquímicas de las células cultivadas y, en consecuencia, afectar el mantenimiento de la homeostasis celular. Es probable que los FGs, así como cualquier otro tipo de célula, puedan sufrir la pérdida de sus características morfo-funcionales, cuando algunos de los elementos esenciales para su cultivo in vitro sean modificados.
Materiales y Métodos
Cultivo Celular de Fibroblastos Gingivales
Los fibroblastos gingivales fueron cultivados a partir de biopsias provenientes de tres (3) donantes clínicamente sanos, sometidos a exodoncia por razones ortodónticas. Los cultivos celulares de FGs fueron realizados durante 7 días, utilizando medio de cultivo DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium), en ausencia y presencia de 10% de SFB. Ambos medios de cultivo fueron reemplazados dos veces por semana hasta la obtención de una confluencia de, aproximadamente, 90%. Una vez alcanzado este porcentaje y manteniendo las mismas condiciones de cultivo, los FGs de cada paciente fueron replicados (pasaje 2) y distribuidos en dos placas, con el propósito de realizar el posterior análisis morfológico e inmunohistoquímico.
Video 1: Cultivo celular: descongelamiento, mantenimiento y congelamiento
Análisis Morfológico e Inmunohistoquímico
La morfología celular fue observada a lo largo de la proliferación por medio del microscopio invertido Axio Vert (Zeiss), con contraste de fase. Los análisis morfológicos e inmunohistoquímicos de la actina, mitocondrias, lisosomas y retículo endoplasmático (RE) fueron usados para evaluar el impacto de la concentración del SFB sobre los FGs.
Procedimiento de Inmunomarcaje:
- Las células fueron permeabilizadas utilizando 0,5% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich®).
- Incubación durante 20 minutos en PBS1X, que contenía 1% de BSA (Sigma-Aldrich®) / 1% de glicina (Sigma-Aldrich®), a temperatura ambiente.
- Las células estuvieron en contacto con los anticuerpos primarios a 4°C, durante toda la noche.
- Las células se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados durante 2h, a temperatura ambiente.
- Los núcleos celulares fueron coloreados con DAPI (Life Technologies Corporation).
- Finalización con el montaje, mediante la solución Immu-MountTM (Thermo Scientific).
Anticuerpos Utilizados:
- Anti-TOMM20 (Rabbit / IgG polyclonal antibody, dilución 1:400, PA5-52843, Thermo Fisher Scientific): para la inmunolocalización de mitocondrias, específicamente la subunidad 20 de la traslocasa de la membrana externa (TOMM20).
- Anti-LAMP1 (Rabbit / IgG polyclonal antibody, dilución 1:400, PA5-95849, Thermo Fisher Scientific): para la identificación de lisosomas, puntualmente la proteína de membrana asociada a lisosoma-1 (LAMP1).
- Anti-calnexin (Rabbit / IgG polyclonal antibody, dilución 1:200, C4731, Sigma-Aldrich®): para la inmunodetención del retículo endoplasmático, a través de la proteína de membrana integral de tipo 1 (calnexina).
- Anticuerpo secundario: Alexa Fluor 488 donkey anti-conejo (1:400 Life Technologies Corporation) para los tres anticuerpos primarios.
La coloración mediante la faloidina fue realizada después de la incubación del segundo anticuerpo, utilizando Alexa FluorTM 594 Phalloidin (Thermo Fisher Scientific), durante 15 minutos, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todas las coloraciones fueron observadas en el microscopio Leica DM2500 LED.
Aspectos Éticos
Para su ejecución, esta investigación tuvo en cuenta las normas éticas establecidas en la declaración de Helsinki y previa lectura, aprobación y firma del consentimiento informado por parte de los participantes.
Resultados
Supervivencia y Crecimiento Celular
Este trabajo realizó la estandarización de las condiciones necesarias requeridas para el cultivo celular de fibroblastos gingivales humanos. Dentro de estas condiciones, se tuvo en cuenta un elemento vital que participa en la supervivencia, el crecimiento y la proliferación de las células cultivadas in vitro, como es la adición al medio de cultivo del SFB. Los fibroblastos gingivales humanos cultivados en presencia de SFB, a una concentración de 10% y su ausencia, mostraron una supervivencia a lo largo de 7 días de cultivo.
En ausencia de SFB (DMEM + SFB 0%) y en presencia de SFB, a una concentración de 10% (DMEM + SFB 10%), los fibroblastos gingivales alcanzaron tasas de confluencia diferenciales al final de una semana. Los resultados indican que los FGs cultivados en presencia de 10% de SFB tuvieron una tasa de crecimiento más elevada en comparación con los FGs cultivados en ausencia de SFB.
Citoesqueleto y Organelas Celulares
La expresión de la actina, elemento fundamental en la arquitectura del citoesqueleto y del movimiento celular, fue inmunodetectada por medio de la faloidina. Una detección positiva de la actina presente en los FGs fue constatada en las dos condiciones de cultivo celular, llevadas a cabo en el presente estudio, junto al marcaje inmunológico de las mitocondrias, los lisosomas y RE.
Mitocondrias:
El inmunomarcaje con TOMM20 permitió constatar la presencia de las mitocondrias en los fibroblastos gingivales (Figura 3). El marcaje de los elementos celulares indica la ausencia de alteraciones en las organelas celulares de los FGs, cuando son cultivados en ausencia de SFB.
Lisosomas:
De manera similar, los resultados indican que en la monocapa de células fibroblásticas gingivales cultivadas en el medio de cultivo 1 (DMEM + SFB 10%) y el medio de cultivo 2 (DMEM + SFB 0%), tuvieron una expresión de la proteína de membrana asociada a los lisosomas-1 (LAMP-1) (Figura 4).
Retículo Endoplasmático:
Con el objeto de conocer el impacto del medio de cultivo con presencia y/o ausencia del SFB sobre las organelas, también se realizó un inmunomarcaje del retículo endoplasmático (Figura 5).
Discusión
Estudios precedentes realizados en diferentes tipos celulares en presencia o ausencia de suero fetal bovino han permitido constatar cómo este componente afecta el rendimiento de los cultivos celulares. El medio de cultivo DMEM hace posible el crecimiento celular in vitro, proporcionando los nutrientes esenciales requeridos por los fibroblastos gingivales. El presente estudio ha demostrado que la utilización de DMEM en ausencia de SFB disminuye la proliferación celular de los fibroblastos gingivales.
Cuando las células fibroblásticas gingivales son cultivadas utilizando DMEM con una concentración de 10% de SFB, estas células alcanzaron un grado de confluencia de 100% en una semana, en comparación con 60-70% de las células con DMEM en ausencia de SFB. Diversas razones pueden justificar por qué la ausencia de SFB disminuyó la proliferación de los fibroblastos gingivales en cultivo. En primer lugar, DMEM sin SFB pudo haber inducido la muerte o la interrupción del ciclo celular de los FGs. En efecto, luego de 24h del cultivo celular, un número no cuantificable de células fibroblásticas flotantes o totalmente separadas del soporte de cultivo fueron observadas en la condición con el medio de cultivo 2. Si un proceso apoptótico fue el responsable de la muerte de los fibroblastos gingivales durante las primeras horas de cultivo y la explicación de por qué la condición de cultivo 1 (DMEM + SFB 10%) no indujo tantas células flotantes, podría ser dilucidado por el hecho de que la ausencia de SFB afectó la interacción de receptores membranales tipo integrinas y, en consecuencia, la producción, la organización y la remodelación de los componentes de la MEC. De hecho, la MEC es la que aporta la integralidad estructural y un microambiente por las células, permitiendo las interacciones celulares de almacenamiento y liberación.